糖醛酸——硫酸咔唑課件

1、1活性多糖動(dòng)物植物微生物海洋生物肝素硫酸軟骨素黃芪多糖枸杞多糖香菇多糖靈芝多糖海洋真菌多糖螺旋藻多糖第一節(jié) 概述: 多糖的分類-來源2組成分類：均一多糖不均一多糖粘多糖：含氮的不均一多糖結(jié)合糖：肽聚糖、脂多糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖糖蛋白通過糖肽鍵(carbohydrate-peptide linkage)將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來,連接方式主要分為-構(gòu)型的N-糖苷鍵和-構(gòu)型的O-糖苷鍵.3糖蛋白有三種主要類型糖蛋白分為三種主要類型：O-糖苷鍵型糖蛋白、N-糖苷鍵型糖蛋白和連有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。在大多數(shù)的O-糖苷鍵型糖蛋白中，GalNAc殘基通過O-糖苷鍵與一個(gè)

2、絲氨酸或蘇氨酸殘基連接形成，縮寫為GalNAc-Ser/Thr。在N-糖苷鍵型糖蛋白中，GlcNAc殘基通過N-糖苷鍵與一個(gè)天冬酰胺殘基相連，縮寫為GlcNAc-Asn。4O-糖苷鍵N-糖苷鍵O- （N-）糖苷鍵型糖蛋白5磷酸乙醇胺殘基磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白6蛋白聚糖 軟骨蛋白聚糖:聚集體的分子量非常大（大約為2108），其中含有透明質(zhì)酸、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素、連接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖鏈。7六員環(huán)糖類似于吡喃，所以又稱之為吡喃糖，而五員環(huán)糖類似于呋喃，稱之為呋喃糖。 環(huán)化單糖中氧化數(shù)最高的碳稱為異頭碳。在環(huán)式結(jié)構(gòu)中，異頭碳是手性碳，所以環(huán)化的醛糖或酮糖可以呈現(xiàn)兩種異頭構(gòu)型中的一種，即

3、-或-構(gòu)型。 吡喃呋喃多糖組成-單糖8葡萄糖環(huán)狀結(jié)構(gòu)9椅式構(gòu)象-D-葡萄糖 -D-葡萄糖 10直鏈淀粉是葡萄糖以-1，4糖苷鍵結(jié)合成的鏈狀化合物 直鏈淀粉11纖維素12多糖的理化性質(zhì)旋光性 硫酸蒽酮反應(yīng)（620nm）硫酸苯酚反應(yīng)(490nm)氨基己糖乙酰丙酮(525nm)糖醛酸硫酸咔唑(520nm)13第二節(jié) 多糖的純度測定 （一）超離心法: 單一區(qū)帶（二）電泳法： 單一色帶（三）凝膠色譜法： 單一洗脫峰（四）旋光法： 均一組分14第三節(jié) 多糖的分子量測定 凝膠色譜法粘度法超離心法高效液相色譜15凝膠層析法凝膠層析法：將分子量不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不

4、同分子量的組分得以分離。最先淋出的是最大的分子。Kd = 0， Ve= V0 ；Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ；0Kd1，Ve=V0+KdVi 。16凝膠色譜法方法：Sephadex G-200，多糖標(biāo)準(zhǔn)品分部收集，硫酸-苯酚檢測，分別求得洗脫體積Ve， Ve與 1gM之間存在著線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 Ve=-KlogM+C將待測樣品上柱，待測多糖Ve。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測多糖分子量。17粘度法、超離心法粘度法：用已知結(jié)構(gòu)相似的多糖決定K值（ K M2），然后測出待測多糖的特性粘數(shù) ，計(jì)算待測多糖的分子量。超離心法：根據(jù)測得的沉降系數(shù)計(jì)算多糖的平均分子量。18高效液相色譜法測定分子量

5、及分布色譜條件： 凝膠柱（分子量大?。静钫酃鈾z測器。標(biāo)準(zhǔn)曲線： 標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogMW = a+b tR MW為重均分子量，tR為保留時(shí)間待測多糖分子量（GPC專用軟件）： 重均分子量 Mw=(RIiMi)/ RIiMi為供試品在保留時(shí)間ti 時(shí)的分子量，RIi在第i部分中被洗脫物質(zhì)的量（重量）。 19第四節(jié)、多糖的含量測定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）生物測定法（肝素鈉）生色底物法（低分子量肝素鈉）20乙酰丙酮法（elson-morgan）氨基己糖原理：氨基己糖在堿性條件下加熱，可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，該衍生物與對二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)物呈紅色，于525nm測

6、定吸收度。21硫酸咔唑法測糖含量硫酸咔唑法己糖醛酸測定在濃硫酸中，己糖醛酸與咔唑溶液反應(yīng)生成的反應(yīng)物呈紅色。 520nm比色22硫酸苯酚法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，該單糖在強(qiáng)酸性條件下，與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物。它在490nm處有最大吸收，其吸光度與濃度呈線性關(guān)系。23蒽酮法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸中水解后，進(jìn)一步脫水生產(chǎn)糠醛類衍生物，與蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，620nm進(jìn)行比色測定。特點(diǎn)：10-100g范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖含量成正比。靈敏度高。24生物測定法肝素測定美國藥典采用羊血漿法。即比較肝素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品延長血漿凝結(jié)時(shí)間的作用來測定肝素的效價(jià)。

7、25生物測定法肝素測定方法標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制:精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按高、中、低劑量組（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化鈉溶液配成三種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值為1:0.7。供試品稀釋液的配制：按供試品的標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)（AT），照標(biāo)準(zhǔn)品溶液與稀釋液的配制法配成高、中、低（ dT1 、dT2、 dT3 ）三種濃度的稀釋液。各管凝結(jié)時(shí)間換算成對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的量反應(yīng)平行線測定法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差?？尚畔蘼剩‵L%）不得大于5%。26生色底物法原理肝素、低分子肝素 當(dāng)?shù)鞍酌福‵a）從生色底物分裂出pNA時(shí)，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價(jià)成反比。405 nm測定

8、。27生色底物Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；對-硝基苯胺（pNA）。酰胺分解法（amidolytic method）。當(dāng)?shù)鞍酌笍纳孜锓至殉鰌NA時(shí)，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價(jià)成反比。 405 nm測定。28生色底物法 抗Xa因子活性測定 以溶液吸收度和濃度的對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線測定法計(jì)算出供試品的抗Xa因子活性 可信限率(FL%)不得大于10%。 29第五節(jié)、多糖類藥物的結(jié)構(gòu)分析單糖組成糖苷鍵連接方式糖苷鍵連接位置DNA蛋白質(zhì)多糖基本單元4種核苷酸天然20種氨基酸200多種單糖，常見20余種每種單糖存在異構(gòu)體連接鍵3-5磷酸二酯鍵N-C

9、肽鍵1-1, 1-2, 1-3, 1-4,1-6糖苷鍵連接鍵構(gòu)型一種一種存在、兩種構(gòu)型302個(gè)相同單糖連接形成的雙糖有11種Glc-Glc1-1連接1-2連接1-3連接1-4連接1-6連接型三種海藻糖（-，-，-）曲二糖黑曲二糖麥芽糖異麥芽糖型槐糖昆布二糖纖維二糖龍膽二糖2個(gè)相同氨基酸連接形成的二肽僅1種AlaAla二肽與雙糖31（一）多糖組成單糖的分析1、水解方法（1）、完全酸水解法（2）、部分酸水解、堿水解（3）、乙酰解（4）、甲醇解（5）、酶降解2、鑒定32（1）、完全酸水解法 水解難易取決單糖性質(zhì)及構(gòu)型。呋喃型戊聚糖較吡喃型己聚糖易水解，型較型易水解。已聚糖一般用1 mol/L硫酸，7

10、0，8小時(shí)。氨基葡聚糖為4 mol/L鹽酸，100 9小時(shí)。33 （2）、部分酸水解、堿水解選擇溫和的條件水解多糖，使糖鏈中某種類型的鍵特異性地打斷。（3）、乙酰解多糖經(jīng)過乙酰解反應(yīng)（醋酐、冰醋酸）可生成乙?；瘑翁呛凸烟?4（4）、甲醇解多糖鏈在80100條件下與無水甲醇反應(yīng)能將糖鏈變成組成單糖的甲基糖苷。甲基糖苷能轉(zhuǎn)化為三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，進(jìn)行氣相色譜分析。35（5）、酶降解分為外切糖苷酶和內(nèi)切糖苷酶。外切糖苷酶：切下多糖非還原末端的一個(gè)單糖，并對單糖組成和糖苷鍵有專一性要求。內(nèi)切糖苷酶可水解糖鏈內(nèi)部的糖苷鍵，釋放多糖鏈片斷以利于結(jié)構(gòu)分析。362、單糖的分離鑒定氣相色譜法高效液相

11、色譜法氣相色譜法與質(zhì)譜分析連用37氣相色譜法常用的衍生物有： 三甲硅烷（TMS）衍生物 三氟乙酰（TEA）衍生物 乙酰（AC）衍生物 甲基（Me）衍生物38二、糖苷鍵連接方式的測定紅外光譜糖苷鍵類型確定吡喃糖糖苷鍵時(shí)，用紅外光譜，在890cm-1處有特征吸收者，示有-型糖苷鍵，在840cm-1處有特征吸收者，示有-型糖苷鍵。核磁共振譜糖苷鍵（型或型）。H-NMR譜中的化學(xué)位移5.4 和 5.1 ，有兩個(gè)信號(hào)說明分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵為型，如有 4.53說明有型。39三、糖苷鍵連接位置的測定（一）、高碘酸氧化、Smith降解（二）、甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析（三）、乙酰解后質(zhì)譜分析40（一）高碘酸氧化、Sm

12、ith降解原理：選擇性的氧化降解反應(yīng)，能夠作用于多糖分子中1，2二羥基和1，2，3三羥基，生成過碘酸氧化產(chǎn)物；此產(chǎn)物用硼氫化鈉還原后，再用酸水解，生成相應(yīng)的醛、甲酸。室溫下用稀無機(jī)酸水解還原產(chǎn)物。411，2連接的糖苷鍵 1，2連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及甘油醛。方程式：421，3連接的糖苷鍵1，3連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應(yīng)，經(jīng)還原與水解后得到原來的單糖。方程式：431，4連接的糖苷鍵1，4連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原，用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。44 1，6連接的糖苷鍵 1，6連接的糖苷鍵經(jīng)高

13、碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及乙醇醛。45（二）甲基化反應(yīng)產(chǎn)物分析原理：多糖經(jīng)甲基化試劑作用使分子中的羥基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以氣相色譜鑒定甲基化水解產(chǎn)物。如多糖分子中帶有支鏈，甲基化水解后可生成二甲基單糖。46（三）乙?；筚|(zhì)譜分析原理：多糖經(jīng)過乙?；磻?yīng)（醋酐、冰醋酸）生成乙?；瘑翁呛凸烟恰Ｓ寐确鲁樘?，蒸去氯仿，進(jìn)行質(zhì)譜分析。分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰，表明有支鏈結(jié)構(gòu)。47品種來源類別劑型右旋糖酐 20發(fā)酵血漿代用品粉劑右旋糖酐 20葡萄糖注射液右酐20、葡萄糖血漿代用品注射劑右旋糖酐 20氯化鈉注射液右酐2

14、0、氯化鈉血漿代用品注射劑右旋糖酐 40發(fā)酵血漿代用品粉劑右旋糖酐 40葡萄糖注射液右酐40、葡萄糖血漿代用品注射劑右旋糖酐 40氯化鈉注射液右酐40、氯化鈉血漿代用品注射劑右旋糖酐 70發(fā)酵血漿代用品粉劑右旋糖酐 70葡萄糖注射液右酐70、葡萄糖血漿代用品注射劑右旋糖酐 70氯化鈉注射液右酐70、氯化鈉血漿代用品注射劑右旋糖酐鐵絡(luò)合物抗貧血藥粉劑右旋糖酐鐵片右酐鐵抗貧血藥片劑右旋糖酐鐵注射液右酐鐵抗貧血藥注射劑肝素鈉豬、牛腸粘膜抗凝血藥粉劑肝素鈉注射液肝素鈉抗凝血藥注射劑肝素鈉乳膏肝素鈉抗凝血藥軟膏硫酸軟骨素鈉豬喉骨、鼻中骨、氣管酸性粘多糖類粉劑硫酸軟骨素鈉片硫酸軟骨素鈉酸性粘多糖類片劑硫酸

15、軟骨素鈉膠囊硫酸軟骨素鈉酸性粘多糖類膠囊劑2015年版中國藥典收載的多糖類藥品48實(shí)例：右旋糖酐（dextran）右旋糖酐，又稱葡聚糖，是若干個(gè)葡萄糖脫水形成的聚合物。微生物多糖，也是第一個(gè)工業(yè)化的微生物多糖，是由腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）發(fā)酵產(chǎn)生的。產(chǎn)物的分子量很大，經(jīng)水解后，用不同濃度乙醇多定分級沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。臨床上使用的是平均分子量為1600024000，3200042000和6400076000的右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，它們均是用做代血漿。49一、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)右旋糖酐的結(jié)構(gòu)：它主要由葡萄糖（16）-

16、糖苷鍵連接而成，同時(shí)含有(13)-和(14)-糖苷鍵連接形成的分支結(jié)構(gòu)。右旋糖酐為白色無定形粉末，無臭、無味，易溶于熱水。右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的膠體溶液，在乙醇等有機(jī)溶劑中不溶。50二、鑒別右旋糖酐經(jīng)堿性水解后產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+還原為紅色氧化亞銅沉淀。操作方法：取本品0.2 g，加水5 ml溶解后，加氫氧化鈉試液2 ml與硫酸銅試液數(shù)滴，加熱后變成紅棕色沉淀 。51三、檢查右旋糖酐的檢查項(xiàng)目較多，其中氯化物、重金屬、干燥失重、熾灼殘?jiān)臋z查參見中國藥典2015年版二部附錄，此外還有氮、分子量與分子量分布的檢查。氮:用發(fā)酵法制備右旋糖酐時(shí)，發(fā)酵濾液中存在著微量蛋白質(zhì)。52氮取本品0.2 g，置50 ml凱氏燒瓶中，加硫酸1 ml，加熱消化至供試品成黑色油狀物，放冷，加30%過氧化氫溶液2 ml，加熱消化至溶液澄清，冷卻至20以下，加水10 ml，滴加管中，再用水稀釋至刻度，緩緩加堿性碘化汞鉀試液2 ml，隨加隨搖勻；如顯色，與標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(每1 ml相當(dāng)于10 g的N)1.4 ml加硫酸0.5 ml用同一方法處理后顏色比較，不得更深(0.007%)。53分子量與分子量分布右旋糖酐20： 3500 7萬右旋糖酐40： 5000 12萬右旋糖酐70： 15000 18.5萬54四、含量測定旋光光度法，根據(jù)右旋糖酐水溶液的旋光度在一定范圍內(nèi)與濃度成正比