國自然基金標(biāo)書參考范文

1、真核起始因子X-Y軸調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶對腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制摘要：大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中，肝、肺轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移模式，對其機(jī)制一直未能闡明。申請者在前期工作中建立了大腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特征分子譜式，在肝轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志中，發(fā)現(xiàn)真核起始因子Z家族的成員：X和Y具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。X-Y軸能夠介導(dǎo)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，X可促進(jìn)細(xì)胞獲得運動能力，并且在轉(zhuǎn)移灶中通過Y的相互作用促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。進(jìn)一步實驗證實，X能調(diào)節(jié)下游糖基轉(zhuǎn)移酶，可能存在激活腸癌細(xì)胞膜表面半乳糖殘基，從而通過與肝細(xì)胞膜上特異性受體相互作用而使腸癌細(xì)胞“定居”于肝臟的機(jī)制，可見X-Y調(diào)節(jié)軸對于大腸癌肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。本項目擬在此基礎(chǔ)上，從大樣本回

2、顧性分析中總結(jié)X-Y對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性和預(yù)后判斷價值。同時，在細(xì)胞和動物模型中進(jìn)一步深入探討其在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移調(diào)控中的作用方式和調(diào)控分子機(jī)制，解析下游效應(yīng)途徑及靶點。（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000 字）：一、立項依據(jù)大腸癌是一種發(fā)生在結(jié)腸或者直腸中的癌癥，是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病人約八百萬，占所有惡性腫瘤的10%-15%，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的第三位1。隨著手術(shù)、化療、放療水平的提高，大腸癌患者的生存率有了較大的提高，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的最主要因素。在美國大腸癌中有90%的死亡由腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移所致2。所以，通過對大腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，正確認(rèn)識大腸癌

3、術(shù)后轉(zhuǎn)移模式，對于制定合理的術(shù)后隨訪方案，采取有針對性的干預(yù)措施，提高生存率至關(guān)重要。大腸癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位是肝臟和肺。對于肝轉(zhuǎn)移，人們更多的把原因歸結(jié)為解剖因素，結(jié)腸是通過門靜脈系統(tǒng)回流進(jìn)入肝臟，所以認(rèn)為大腸癌的首發(fā)轉(zhuǎn)移部位往往在肝臟。但是很多臨床研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移可以繞開肝臟而首先出現(xiàn)在肺部甚至是甲狀腺轉(zhuǎn)移3-6，有報道出現(xiàn)首發(fā)肺轉(zhuǎn)移的大腸癌患者最高可達(dá)患者總數(shù)的6%，已經(jīng)相當(dāng)可觀7，這就對我們的隨訪策略提出挑戰(zhàn)，對于大腸癌患者即使術(shù)后沒有肝轉(zhuǎn)移，也不能放松對肺部的檢查。而申請者在前期臨床研究中，通過對本院486例行根治手術(shù)的大腸癌患者資料研究后發(fā)現(xiàn)：主要通過門靜脈系統(tǒng)回流的高

4、位直腸癌和通過體循環(huán)回流的直腸中、低位直腸癌的術(shù)后肺轉(zhuǎn)移率和肝轉(zhuǎn)移率都沒有顯著性差異。由此可見，決定大腸癌的術(shù)后轉(zhuǎn)移模式的因素并非僅僅解剖可以闡釋。近年來研究發(fā)現(xiàn)包括原發(fā)腫瘤的分期，術(shù)前放化療，轉(zhuǎn)移靶器官的微環(huán)境等因素都會影響大腸癌的轉(zhuǎn)移模式8-10，但其確切機(jī)制仍然沒有探明。為搜尋大腸癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)分子靶標(biāo)并評估其作為預(yù)測遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生的潛在分子標(biāo)志物的可能性，我們前期在臨床上收集了6例珍貴的同時性肝、肺轉(zhuǎn)移分別切除的患者，將其原發(fā)灶、肝、肺轉(zhuǎn)移的組織樣本通過高通量的基因芯片技術(shù)，從全基因表達(dá)譜的角度對這兩種轉(zhuǎn)移組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行了全方位的檢測分析（來源于同一患者的組織樣本可以排除個體遺傳

5、背景的干擾）。我們發(fā)現(xiàn)：有41個基因在兩種大腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織中存在顯著性差異（肝轉(zhuǎn)移分子群有27個，肺轉(zhuǎn)移分子群有14個），這些分子可能構(gòu)成了驅(qū)動大腸癌不同轉(zhuǎn)移模式的分子因素。為進(jìn)一步確認(rèn)芯片的結(jié)果，我們在47例大腸癌肝轉(zhuǎn)移和22例肺轉(zhuǎn)移組織病理樣本中，通過qPCR的方式進(jìn)行了回顧性驗證，確認(rèn)了13個在大腸癌肝轉(zhuǎn)移過程中明顯高表達(dá)的基因（5倍以上），區(qū)別于肺轉(zhuǎn)移，這是一種特異性的表達(dá)改變（見前期工作）。這些肝轉(zhuǎn)移特異的分子標(biāo)志中，有兩個屬于真核起始因子Z家族的成員：X和Y，引起了我們的研究關(guān)注。Z真核起始因子在真核生物翻譯起始過程中起著重要作用，參與了真核生物翻譯起始過程中的多個反應(yīng)11，但其

6、在腫瘤中的角色功能還尚不十分清楚。我們首先鑒定了Y基因在大腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，并確認(rèn)Y表達(dá)被干擾后，細(xì)胞增殖能力被顯著抑制，處于G1期的細(xì)胞數(shù)量顯減少，處于S期和G2期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，細(xì)胞凋亡比例顯著提高，細(xì)胞的存活能力顯著下降，克隆形成能力受到顯著抑制。這一結(jié)果已發(fā)表于XXX12?？紤]到有報道X與Y之間存在相互結(jié)合13-14，我們又進(jìn)一步觀察了兩者之間的交互作用。有意思的是，X對于Y的促惡性增殖功能是必需的，表現(xiàn)在沉默X表達(dá)之后，過表達(dá)Y對大腸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控失活。而X本身具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的能力，抑制X可顯著降低細(xì)胞運動性（見前期工作）。由此，我們提出科學(xué)假設(shè)：真核起始因子X-Y軸能夠調(diào)控

7、大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，X可介導(dǎo)細(xì)胞獲得運動能力，并且在轉(zhuǎn)移灶中調(diào)節(jié)Y發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性增殖的作用，具體作用機(jī)制有待闡明。在哺乳動物中，Z因子的亞基有8種，按分子量從大到小排列而命名15。Z因子參與真核細(xì)胞翻譯過程，而調(diào)節(jié)蛋白合成在維持細(xì)胞生長控制中起重要作用16。據(jù)報道，Z因子不僅能通過促進(jìn)mRNA與40s亞基結(jié)合，而且還可以獨自與游離的40s亞基結(jié)合，影響40s亞基與60s亞基及其他亞基蛋白的結(jié)合或解離等17。Z家族成員一般含有PCI和MPN結(jié)構(gòu)域，這兩類結(jié)構(gòu)域都參與蛋白-蛋白相互作用，部分還具有RNA識別（RNA recognition motif，RRM）結(jié)構(gòu)域，可能參與RNA的結(jié)合1

8、5。除此之外，Z因子還被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細(xì)胞周期的作用16,18。通過調(diào)節(jié)不同類型的mRNA的翻譯起始，Z因子就可以選擇性地調(diào)控蛋白的合成，從而對腫瘤細(xì)胞的生長的轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控16,19。Z家族中部分成員已證實在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，已報道的包括：A、B、C、D等18-22。Y的致癌作用由申請人首先報道，隨后其在膠質(zhì)瘤和呼吸系統(tǒng)腫瘤中的作用也被其他研究者發(fā)現(xiàn) 12,23-25。而關(guān)于X與惡性腫瘤的關(guān)系目前還未見文獻(xiàn)報道，可見在針對X、Y兩個分子尤其是交互作用方面，申請人尚居于領(lǐng)先的研究地位。更早前，權(quán)威雜志J Biol Chem上的報道提示了X在包含Y蛋白的復(fù)合物與40S核糖體

9、亞基結(jié)合的過程中扮演著關(guān)鍵的鏈接作用，缺失X時兩者的結(jié)合很不穩(wěn)定，對翻譯起始系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力也會降低26。2013年9月，J Biol Chem上又報道了W可與X競爭性結(jié)合Y27，從而形成不同的Z復(fù)合物。Z復(fù)合物負(fù)責(zé)招募tRNA或mRNA，可調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，繼而影響腫瘤細(xì)胞的生長、遷移等生物學(xué)過程。不同的Z因子蛋白結(jié)合可能存在不同的翻譯調(diào)節(jié)機(jī)制從而執(zhí)行不同功能作用。在近期的研究工作中，申請人對X的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步深入。敲減X后，基因芯片檢測顯示腸癌細(xì)胞中多個關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點發(fā)生了改變。其中，有3個半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（1,3-GalT; 1,4-GalT-1; 1,4-GalT-7）的表達(dá)降低了，這

10、引起了我們的興趣。糖基化作為常見的蛋白翻譯后修飾，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲、免疫應(yīng)答等多種生命活動，糖基化紊亂能夠?qū)е露喾N腫瘤的發(fā)生與惡性轉(zhuǎn)化，糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和活性與包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的惡性化程度相關(guān)28-29。Tang等發(fā)現(xiàn)1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1通過調(diào)節(jié)EGFR影響肝癌細(xì)胞的生長和凋亡30。1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶3通過調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白信號通路影響神經(jīng)細(xì)胞瘤的侵襲能力31。此外，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的激活，可以使細(xì)胞膜上蛋白糖基化程度增加32。經(jīng)過進(jìn)一步腸癌細(xì)胞株的體外實驗驗證，X與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1,4-GT-1和1,4-GT1-7的表達(dá)正相關(guān)（見前期工作），我們推測X對半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的

11、調(diào)節(jié)作用很可能是它在腸癌中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。原因在于，肝細(xì)胞表面存在一種特異性表達(dá)的抗原：去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor, ASGPR），又稱半乳糖受體。ASGPR是一種跨膜蛋白，主要表達(dá)于哺乳動物肝竇狀隙的肝實質(zhì)細(xì)胞表面，密度很高，每個細(xì)胞表面可多達(dá)500,000個受體，其胞外結(jié)構(gòu)域含有糖識別結(jié)構(gòu)域，能識別和結(jié)合半乳糖殘基和-乙酰半乳糖胺殘基33。Misawa等34曾經(jīng)用神經(jīng)氨酸酶處理骨髓細(xì)胞（Bone marrow cell，BMCs），使細(xì)胞膜表面的糖蛋白脫去唾液酸而暴露出半乳糖殘基，利用半乳糖殘基與ASGPR的相互作用使BMCs直接聚

12、集到肝臟。我們相信，真核起始因子X在腸癌肝轉(zhuǎn)移的過程中，可能調(diào)節(jié)下游糖基轉(zhuǎn)移酶，存在一種通過激活腸癌細(xì)胞膜表面半乳糖殘基，從而與肝細(xì)胞膜上特異性受體ASGPR相互作用而使腸癌細(xì)胞“定居”于肝臟的機(jī)制，此后，它又可介導(dǎo)Y的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞克隆化增殖的能力，最終形成肝組織腫瘤轉(zhuǎn)移灶。X-Y調(diào)節(jié)軸對于大腸癌肝轉(zhuǎn)移的內(nèi)在調(diào)節(jié)機(jī)理是令人期待的。在前期工作基礎(chǔ)上，本項目擬從大樣本回顧性分析中總結(jié)X-Y對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床相關(guān)性和預(yù)后判斷價值。同時，在細(xì)胞和動物模型中進(jìn)一步深入探討其在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移調(diào)控中的作用方式和調(diào)控分子機(jī)制：解析X調(diào)節(jié)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的方式和作用靶點，明確其介導(dǎo)的信號通路，并確認(rèn)X在Y復(fù)

13、合物發(fā)揮功能的效應(yīng)分子途徑中的作用。以上研究在組織、細(xì)胞、動物三個層次展開，并通過分子機(jī)制研究進(jìn)行縱向的突破，以期獲得高水平的研究成果。本項目是對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制的研究深入，所獲得的研究成果可幫助我們更好判斷腸癌預(yù)后，通過肝轉(zhuǎn)移特征性的分子標(biāo)志，提示風(fēng)險，并為相關(guān)靶點應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)奠定理論基礎(chǔ)。主要參考文獻(xiàn)因涉敏感基因信息，略二、項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題1、研究內(nèi)容回顧性檢測500例腸癌患者手術(shù)標(biāo)本中X和Y蛋白的表達(dá)水平，根據(jù)臨床病理數(shù)據(jù)和隨訪數(shù)據(jù)多因素分析X、Y表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關(guān)性，嘗試建立基于X、Y表達(dá)的分子預(yù)測模型，評價這一預(yù)后指標(biāo)的臨床適用價值

14、。在腸癌細(xì)胞株中過表達(dá)和沉默X、Y基因，觀察細(xì)胞功能變化。在細(xì)胞實驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用裸鼠成瘤和肝轉(zhuǎn)移動物模型進(jìn)行驗證，觀察X、Y對于腸癌惡性增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響。結(jié)合細(xì)胞、動物和組織水平的研究數(shù)據(jù)闡明X、Y在腸癌發(fā)生、進(jìn)展中的功能作用。根據(jù)前期工作的下游通路和靶分子分析結(jié)果，重點闡明：X與糖基轉(zhuǎn)移酶之間的調(diào)控關(guān)系和作用靶點；X與細(xì)胞運動性信號通路靶分子的調(diào)節(jié)關(guān)系；Y復(fù)合物調(diào)節(jié)的信號通路與效應(yīng)分子；X與Y相互結(jié)合的序列位點和精細(xì)調(diào)控。2研究目標(biāo)及考核的技術(shù)指標(biāo)基于Y在腸癌細(xì)胞高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖和周期改變，X與Y之間存在相互結(jié)合，而X具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的能力，申請者的研究目標(biāo)在于證實X-Y軸能夠調(diào)

15、控大腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，X可介導(dǎo)細(xì)胞獲得運動能力并在轉(zhuǎn)移灶中調(diào)節(jié)Y發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼發(fā)性增殖的作用。而在體內(nèi)、體外明確其促肝轉(zhuǎn)移功能作用基礎(chǔ)上，X調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制通過以下兩個目標(biāo)進(jìn)行深入探討：1) 闡明Y復(fù)合物調(diào)節(jié)的信號通路與效應(yīng)分子；2) 確認(rèn)X與Y相互結(jié)合的序列位點和精細(xì)調(diào)控；3）探討X調(diào)節(jié)大腸癌肝轉(zhuǎn)移模式的具體作用機(jī)制。3擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題及其解決方法本課題所需解決的第一個關(guān)鍵科學(xué)問題為X和Y在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的臨床意義，通過大樣本組織中檢測這兩個分子的表達(dá)，并利用病理和隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，我們可以獲得多因素條件下這兩個靶標(biāo)的臨床價值。這其中，規(guī)范化的組織樣本庫，隨訪數(shù)據(jù)的積

16、累以及統(tǒng)計方法的運用都是重要的影響因素，但申請者所在課題組在這方面從事過多個課題的研究，具有豐富經(jīng)驗。另一方面，這兩個靶標(biāo)的檢測有成熟的商業(yè)化抗體，方法學(xué)上也不存在困難。本課題第二個關(guān)鍵問題也是本課題研究的重點，即X-Y軸在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的調(diào)控分子機(jī)制，我們需要闡明Y所介導(dǎo)的遷移功能及糖基轉(zhuǎn)移酶信號途徑的效應(yīng)分子和作用方式，并且確認(rèn)Y與X結(jié)合的精細(xì)調(diào)控及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。這方面的工作依賴于扎實的前期工作，首先，我們已經(jīng)得到Y(jié)和X沉默后功能表型的結(jié)果，即Y可調(diào)控細(xì)胞增殖，而X能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，并影響Y對腫瘤的促增殖作用，在此基礎(chǔ)上做機(jī)制研究有的放矢。其次，我們已篩查和驗證到X可通過調(diào)節(jié)

17、兩個糖基轉(zhuǎn)移酶對腸癌細(xì)胞肝臟種植起到調(diào)節(jié)作用，在本課題中，我們需要深入做的工作是揭示X如何調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移功能，其下游調(diào)節(jié)糖基轉(zhuǎn)移酶是否與肝臟特異性的轉(zhuǎn)移相關(guān)，以及它們具體的作用機(jī)制是怎樣的。在邏輯清晰的機(jī)制通路假設(shè)中，我們只需逐條驗證，即可真正揭開X作用通路的神秘面紗。最后，Y和X之間的cross-talk有創(chuàng)新性且立足于前期研究的數(shù)據(jù)支持，只需將X-Y復(fù)合物調(diào)節(jié)的位點和下游與細(xì)胞增殖功能相關(guān)的機(jī)制闡釋清楚，即可形成完成的研究故事。考慮到腫瘤細(xì)胞增殖機(jī)制方面報道眾多，可參考模式豐富，這方面的研究也不會有太大的科學(xué)風(fēng)險。三、擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析1. 技術(shù)路線備注：藍(lán)色背

18、景填充部分為前期已完成工作。2. 研究方法2.1 X、Y在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用和預(yù)后相關(guān)性回顧性收集腸癌臨床標(biāo)本500例，取手術(shù)切除的腸癌組織、匹配的肝臟轉(zhuǎn)移灶手術(shù)和穿刺標(biāo)本，新鮮組織液氮保存標(biāo)本200例，石蠟塊300例，全部病例均通過臨床、影像學(xué)、病理診斷，術(shù)前未進(jìn)行輔助治療，來自某某醫(yī)院2008-2013年臨床收治病例，隨訪資料齊全。 免疫組化檢測組織切片中X、Y蛋白的表達(dá)及定位，分別設(shè)立陰性對照、腫瘤對照、肝轉(zhuǎn)移對照。SPSS16.0統(tǒng)計軟件對X、Y表達(dá)及定位與臨床標(biāo)本進(jìn)行病理關(guān)聯(lián)性分析和預(yù)后統(tǒng)計分析，了解X、Y表達(dá)情況與相關(guān)臨床資料之間的關(guān)系，單因素生存分析對臨床各項指標(biāo)與結(jié)腸癌生

19、存期進(jìn)行相關(guān)性分析，建立Cox比例風(fēng)險回歸模型，綜合探討臨床各因素和X、Y表達(dá)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移灶形成及預(yù)后的相關(guān)性。2.2 體外、體內(nèi)水平研究X、Y基因在腸癌肝轉(zhuǎn)移中的調(diào)節(jié)功能制備X-shRNA慢病毒，建立X穩(wěn)定沉默的細(xì)胞株，以無義序列作為陰性對照，利用MTT實驗觀察X沉默后細(xì)胞的生長曲線；克隆形成實驗檢測X沉默后細(xì)胞的克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合PI單染、Annexin-V雙染檢測細(xì)胞周期和凋亡情況；細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細(xì)胞運動能力的變化。與此同時，制備過表達(dá)X的慢病毒載體。在穩(wěn)定沉默X的結(jié)腸癌細(xì)胞中，導(dǎo)入過表達(dá)Y的慢病毒載體，利用細(xì)胞生長曲線觀察X沉默且Y過表達(dá)后細(xì)

20、胞的增殖能力變化；細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細(xì)胞運動能力的變化。同樣地，在穩(wěn)定沉默Y的結(jié)腸癌細(xì)胞中，導(dǎo)入過表達(dá)X的慢病毒載體，利用細(xì)胞生長曲線觀察Y沉默&X過表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力變化；細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗觀察細(xì)胞運動能力的變化。制備結(jié)腸裸鼠皮下移植瘤模型，觀察腫瘤生長情況，建立生長曲線，統(tǒng)計分析Y和X對結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響，明確Y和X在結(jié)腸癌惡性增殖的作用。實驗分組：空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達(dá)組、Y沉默組+X過表達(dá)組。建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型，觀察肝臟中的轉(zhuǎn)移灶，統(tǒng)計分析Y和X對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移能力的影響，明確Y和X在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過程中的

21、作用。實驗分組：空白對照、Y沉默組、X沉默組、X沉默組+Y過表達(dá)組、Y沉默組+X過表達(dá)組。處死裸鼠取得的腫瘤組織，利用qRT-PCR和免疫組化方法檢測Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表達(dá)；部分腫瘤組織制備成冰凍切片，利用FITC和TRITC雙標(biāo)記免疫熒光染色，使用激光共聚焦顯微鏡觀察X與Y的共定位情況。2.3. X-Y軸調(diào)節(jié)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究通過基因芯片Microarray分析X過表達(dá)/沉默后基因表達(dá)譜變化情況，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化，差異表達(dá)分析，明確X消減后表達(dá)發(fā)生改變的下游調(diào)控分子，芯片結(jié)果中有顯著差異的潛在作用分子，設(shè)計引物，通過qRT-PCR進(jìn)行二次表達(dá)驗證。

22、X基因過表達(dá)/沉默后發(fā)生顯著表達(dá)差異的基因，利用Bayesian Network、Genes2Networks、Go-anaslysis軟件進(jìn)行signaling network 重建。解析X調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞運動能力的信號通路網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建X為核心的信號分子網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)X基因沉默后影響的信號通路結(jié)果（半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其上游調(diào)節(jié)信號通路），利用信號通路抑制劑處理X穩(wěn)定過表達(dá)/沉默后結(jié)腸癌細(xì)胞和對照細(xì)胞，檢測不同分子信號對X表達(dá)及功能的作用，驗證阻斷這些信號通路后對X在結(jié)腸癌中的功能表型的影響。采用信號通路高通量檢測蛋白芯片，根據(jù)以上實驗分析的通路情況，訂購相應(yīng)通路的Pathway Array試劑盒，按試

23、劑盒操作，依據(jù)封閉、加入細(xì)胞裂解液、洗脫、加入抗體混合液、再次洗脫，加入辣根過氧化物酶HRP并洗脫、信號檢測的步驟，檢測X基因表達(dá)變化后的特定通路關(guān)鍵蛋白的變化。分別構(gòu)建X、Y的真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)293T，通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證XY的相互結(jié)合作用。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)模擬X與Y的結(jié)合位點。在結(jié)合位點制備不同氨基酸的突變體。采用RNAi方法敲減互作蛋白表達(dá)，接著轉(zhuǎn)入互作蛋白的突變體，檢測細(xì)胞功能表型變化。通過免疫共沉淀（Co-IP）驗證X與Y之間的結(jié)合位點特異性。EMSA實驗驗證X與Y之間的相互作用關(guān)系，參考蛋白相互作用實驗，設(shè)計突變載體，再驗證其結(jié)合特異性，由此揭示X作為Y調(diào)節(jié)蛋白其對

24、下游RNA進(jìn)行調(diào)控的精細(xì)機(jī)制。3. 可行性分析研究目標(biāo)切實可行：我們前期的工作已明確證實：Y可以調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的惡性增殖，并且進(jìn)行了大量的預(yù)實驗，可支持本課題主要科學(xué)假設(shè)。本項目是對前期研究工作的進(jìn)一步補(bǔ)充和完善，具有較好的可行性。技術(shù)平臺與硬件設(shè)施完善：課題組成員長期從事結(jié)直腸癌的診治和發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究，在免疫組化、免疫印跡、實時熒光定量PCR、RNA 干擾、慢病毒包裝、表達(dá)譜芯片研究等各個方面積累了大量的經(jīng)驗，本項目中所用到的實驗技術(shù)以前均有所涉及，為本項目的實施提供了技術(shù)保障。本項目所需的主要儀器設(shè)備目前均已經(jīng)具備。研究基礎(chǔ)扎實：本課題組成員長期從事結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)和臨床研究，具有良好的科研素質(zhì)。在國內(nèi)外雜志上發(fā)表了多篇結(jié)直腸癌基礎(chǔ)研究和臨床研究相關(guān)的論文。臨床標(biāo)本充足：仁濟(jì)醫(yī)院普