第四節(jié)營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選

1、誘變育種誘變劑誘變育種步驟物理誘變劑化學(xué)誘變劑出發(fā)菌株的選擇單孢子懸液的制備菌絲尖端法處理菌落周圍的尖端菌絲混合培養(yǎng)法原生質(zhì)體是異質(zhì)的不具有細(xì)胞壁不產(chǎn)孢子的菌株誘變時會有遺傳分離或遺傳不穩(wěn)現(xiàn)象誘變處理誘變劑種類選擇最適誘變劑劑量的選擇誘變劑的處理方式影響突變率的因素1、菌種的遺傳特性不同2、菌體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同3、環(huán)境條件的影響 誘變前預(yù)培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng) 溫度、pH、氧氣等外界條件 對誘變效應(yīng)的影響 平皿密度效應(yīng)1第三節(jié)營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選 營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。 目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。 研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。營養(yǎng)缺

2、陷型的用途2一、基本概念二、篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟（一）誘變（二）淘汰野生型（三）檢出缺陷型（四）確定生長譜31、野生型菌株（wild type strain）2、營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）： 指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。3、原養(yǎng)型（prototroph）： 營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組變異后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上相同。一、基本概念：4與之有關(guān)的培養(yǎng)基有三類1、基本培養(yǎng)基(MM)：minimal medium 能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基；-2、完全培養(yǎng)基(CM)：compl

3、ete medium 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)要求的天然或半合成培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基；+3、補充培養(yǎng)基(SM)：supplemental medium 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分；AB5二、篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟誘變淘汰野生型檢出缺陷型確定生長譜6（一）誘變方法用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型的誘變劑有：亞硝基胍紫外線亞硝酸71、抗生素法：原理：一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。2、菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。3、高溫殺菌法：利用芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異。（二）淘汰野生型MMC

4、MCMMMMMCM加青霉素8 （三）缺陷型的撿出原理：缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點種法 夾層法 、限量補充法無營養(yǎng)缺陷MM MM+FCM其他營養(yǎng)缺陷F營養(yǎng)缺陷9（1）將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。（2）完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。（3）將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。 、影印法10（4）將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。（5）二平皿相同方位進(jìn)行比較，即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于CM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于

5、CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。MMCM11 、點種法 用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。 此法結(jié)果明確，但工作量大。CMCMMM12 、夾層法 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。 此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易?；经傊囵B(yǎng)基含菌的MMCM13該法有兩種情況：（1）目的是撿出營養(yǎng)缺陷型方法是將富集培養(yǎng)后的細(xì)胞接種到含有0.01%蛋白胨的MM上培養(yǎng)，野生型