單克隆抗體制備(2)

1、關(guān)于單克隆抗體的制備 (2)第一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是單克隆抗體？1、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）： 由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體 稱為單克隆抗體。 與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。第二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體制備原理 -第三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體雜交瘤技術(shù)基本流程 第四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 在培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤，收集增殖細(xì)胞！3種雜交細(xì)

2、胞：B-B融合細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞 瘤-瘤融合細(xì)胞未融合的細(xì)胞：單個的B細(xì)胞、單個的骨髓瘤細(xì)胞這五種細(xì)胞中， 沒有分裂能力，逐漸衰老死亡； 的DNA復(fù)制只有D途徑， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途徑阻斷，也逐漸衰老死亡，但的DNA復(fù)制有D、S兩條途徑，雖然D途徑被氨基嘌呤阻斷，但是還可以通過 S 途徑進(jìn)行DNA的復(fù)制，使細(xì)胞有分裂能力。第五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟 一：免疫原的制備 ：1：完全抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì)2：半抗原：多糖、藥物、激素、肽類等分子量小于5000

3、 Da 物質(zhì)3：半抗原需與BSA、OVA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價(jià)的抗體第七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗體的制備步驟 免疫動物的選取：6-8周齡的雌性，純系的Bal B/C。免疫原：細(xì)胞性抗原：（12）107/只，不加佐劑，23周重復(fù)一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，36周 100200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫。免疫程序： 免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、 間隔時(shí)間、佐劑的選擇。二.動物免疫第八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟 抗原接種第九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗

4、體的制備步驟 三：細(xì)胞融合細(xì)胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠產(chǎn)生特異性的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞,在PEG融合劑或是電刺激或是激光刺激來促使細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞。蹄選得到的雜交瘤細(xì)胞繼承了 B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體以及骨髓瘤細(xì)胞無限傳代的特性,并以此進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng),生產(chǎn)出大量的特異性良好的單克隆抗體,為快速診斷試劑的研制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 第十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月所需試劑：培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液，HAT培養(yǎng)液，HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑 作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而 有

5、助于細(xì)胞融合 作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度 與毒性有所不同第十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗體的制備步驟 三.細(xì)胞融合 步驟 1：飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞。第十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 單克隆抗體的制備步驟 1： 將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞5:1混合，加DM液，混勻 2： 離心，棄上清，磨成糊狀 3：將離心管置于37溫水，搖動；邊滴加PEG1450 4：加入DM液 5：離心，棄上清 6：HAT 重懸后加入96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱 7：五天后，15%血清的HAT補(bǔ)液 8：八天后，徹底換15%血清DM液三.細(xì)胞融合第十三張

6、，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA方法篩選陽性孔單克隆抗體的制備步驟四.雜交瘤細(xì)胞及陽性孔的篩選第十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月陽性孔 單克隆抗體的制備步驟 用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要保證每個孔內(nèi)不多于一個細(xì)胞。 抗原抗體雜交法檢測呈陽性反應(yīng) 四.雜交瘤細(xì)胞及陽性孔的篩選間接ELISA方法篩選陽性孔第十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟六：亞克隆是為了獲得穩(wěn)定的陽性菌株對檢測有陽性且敏感性好的細(xì)胞要盡早進(jìn)行克隆化,否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制,因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快,二者競爭的會使

7、產(chǎn)單抗的細(xì)胞丟失第十六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟篩選陽性細(xì)胞孔HAT重懸陽性孔內(nèi)的細(xì)胞取10ul做倍比稀釋目標(biāo)孔：80-100個細(xì)胞將目標(biāo)孔細(xì)胞全部移至適量的HAT溶液中，鋪板每次亞克隆十天后，用ELISA法做抗體檢測，確定陽性孔按上述方法進(jìn)行第二，第三次亞克隆第三次亞克隆結(jié)束后，將確定為陽性孔的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)六：亞克隆每次亞克隆后要進(jìn)行細(xì)胞的凍存保種第十七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟1：在建立雜交瘤細(xì)胞的過程中，有時(shí)一次融合產(chǎn)生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì) 胞凍存起來；另一方

8、面，為了防止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故。2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1 “慢凍”：分步冷凍，30-70液氮保存數(shù)年至數(shù)十年. “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、復(fù) 蘇.七：雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇細(xì)胞冷凍的意義防止污染 、 避免染色體丟失、防止非分泌細(xì)胞的過度生長、防止細(xì)胞密度過高而死亡第十八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟八：如何得到大量的單克隆抗體？動物體內(nèi)誘生法：使用的動物當(dāng)然首選BALB/c小鼠 ,將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。體外培養(yǎng)法： a、懸

9、浮培養(yǎng)法b、微載體培養(yǎng)法Microcarrier c、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) d、微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 第十九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的雜交瘤細(xì)胞以備注入小鼠腹腔誘生腹水時(shí),一定要用無血清培養(yǎng)液多離心幾次,將細(xì)胞培養(yǎng)液含有的牛血清洗凈,防止牛血清進(jìn)入了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的選擇上一定要選擇活力好、腹腔大的小鼠。當(dāng)小鼠腹腔開始發(fā)脹后,每天密切關(guān)注小鼠狀態(tài),取出腹水,立即離心,去除上層的腹腔脂肪,下層有時(shí)會出現(xiàn)細(xì)胞,除去。離心后馬上進(jìn)行純化。第二十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的制備步驟飽和硫酸銨一DEAE離子交換柱法離子交換是指液相中的離子

10、與固定相上可解離基團(tuán)的可逆交換反應(yīng)。利用這個反應(yīng)先將要分離的混合物在一定pH的溶液中解離,而后流經(jīng)固定相,使之與固定相上的可解離基團(tuán)進(jìn)行離子交換,吸附于固定相上,凡不能進(jìn)行交換吸附的成分,則流出層析柱外。當(dāng)pH一7.4時(shí),IgG所帶電荷為零,最先流出柱子。過柱前先用飽和硫酸銨法初步提純。蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中相對溶解度不同,血清丫球蛋白在一定濃度鹽溶液中易于沉淀,而白蛋白則不易沉淀,據(jù)此可將二者分離辛酸一飽和硫酸銨法_在酸性條件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸錢沉淀上清,即可獲得純度較高的I

11、gG。九：單克隆抗體的純化第二十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月單克隆抗體的鑒定單克隆抗體純度的鑒定:用SDS一PAGE電泳鑒定純度單克隆抗體敏感性(IC50)值的測定:間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)中,一般是通過IC50值來判斷抗體對CAP的敏感性,故用7個不同偶聯(lián)比的HAP一OVA進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn),測定不同偶聯(lián)比的包被抗原對應(yīng)的IC50值。單克隆抗體特異性的測定(交叉反應(yīng))做間接競爭ELIsA,計(jì)算各自的ICS。值,計(jì)算交叉反應(yīng)率。如果含有與待測物相似結(jié)構(gòu)或部分相同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)存在交叉反應(yīng),將測定結(jié)果升高,導(dǎo)致假陽性,一般以交叉反應(yīng)率表示,交叉反應(yīng)率越小,說明抗體特異性越好。第二十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測定 將單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗體，作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。ELISA方法用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價(jià)，腹水效價(jià)在