基因克隆載體系統(tǒng)

1、關(guān)于基因克隆的載體系統(tǒng)第一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月概述1、 載體（vector）概念 能將外源DNA分子攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞,并進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)的工具稱(chēng)為載體。用來(lái)進(jìn)行基因組克隆、cDNA克隆或亞克隆的DNA分子。按功能分為克隆載體和表達(dá)載體。第二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2 載體的特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制；有選擇標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選；可插入一段較大的外源DNA分子而不影響自身復(fù)制；有合適的限制性酶切

2、位點(diǎn)第四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 克隆載體用于攜帶DNA片斷進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制或保存的載體稱(chēng)為克隆載體。第五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 主要的克隆載體質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體單鏈DNA噬菌體載體噬菌粒載體動(dòng)物病毒第六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒一般生物學(xué)特性質(zhì)粒的概念質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類(lèi)核酸分子，并不是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的，但可以賦予細(xì)菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的(酵母的殺傷質(zhì)粒是一種R

3、NA)質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb第七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月主要構(gòu)型SC構(gòu)型 cccDNAOC構(gòu)型 開(kāi)環(huán)DNAL構(gòu)型 線性DNA第十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3 質(zhì)粒的基本特性1）自主復(fù)制性復(fù)制起始區(qū)（replication origin) ：通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)（整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子）大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于 pMB1 質(zhì)?；?ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn) 第十一張

4、，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)拷貝數(shù):常指生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基條件下,每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目. 根據(jù)質(zhì)粒在寄主細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃樗沙谛停╮elaxed control ） : 1060copies,高拷貝嚴(yán)緊型（strigent contorl） : 1幾個(gè)copies,低拷貝第十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生質(zhì)粒 p15A10212pSC101 及其衍生質(zhì)

5、粒pSC101 5 ColE1ColE11520第十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）、質(zhì)粒的不相容性（plasmids incompatibility) 在沒(méi)有選擇壓力的情況下,兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一個(gè)寄主體系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，稱(chēng)為質(zhì)粒的不相容性. 在細(xì)胞的增殖過(guò)程中,其中必有一種會(huì)被逐漸地排斥掉,不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群.ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容第十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)質(zhì)粒DNA

6、中是否含有接合轉(zhuǎn)移基因分為接合型質(zhì)粒（能自我轉(zhuǎn)移） ：又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒，除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞非接合型質(zhì)粒（不能自我轉(zhuǎn)移） ： 帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞 （4）可轉(zhuǎn)移性第十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類(lèi)型1、天然質(zhì)粒用做克隆載體的局限性2、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件3、質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記4、不同類(lèi)型的質(zhì)粒載體 第十七張

7、，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、天然質(zhì)粒用做克隆載體的局限性天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建第十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、質(zhì)粒載體必須具備的基本條件具有復(fù)制起點(diǎn)具有抗菌素抗性標(biāo)記具有若干限制性單一酶切位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)(mutiple cloning site簡(jiǎn)稱(chēng)MCS)。具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)第十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記氨芐青霉素 ( Amp )氯霉素 ( Cml )卡那霉素 (

8、Kam )鏈霉素 ( Sm )四環(huán)素 ( Tet )第二十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月篩選標(biāo)記藍(lán)白斑篩選插入失活第二十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、不同類(lèi)型的質(zhì)粒載體高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 ( Col E1、pMB1):拷貝數(shù)1000-3000 擴(kuò)增基因 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 ( F因子、pSC101):來(lái)自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達(dá)某些毒性基因失控的質(zhì)粒載體 :一類(lèi)溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒 插入失活型的質(zhì)粒載體 :載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329 正選擇的質(zhì)粒載體:直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞.只有帶有選擇標(biāo)

9、記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如pUR2、pTR262等表達(dá)型質(zhì)粒載體:在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)的克隆載體特稱(chēng)為表達(dá)載體.第二十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體第二十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1）元件來(lái)源復(fù)制起點(diǎn):來(lái)源于ColE1 的派生質(zhì)粒 pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)Ampr基因:來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的Ampr基因Tetr基因:來(lái)源于pSC101的Tetr 基因第二十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pBR322的優(yōu)點(diǎn) 具氨芐青霉素和四環(huán)素雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記 分子小，

10、克隆能力大 載體越小越好，10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂 高拷貝數(shù) 氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)10003000copy 安全 失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移pBR322的缺點(diǎn)保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mob）的作用位點(diǎn)，能夠被ColK質(zhì)粒編碼的mob蛋白識(shí)別，如果再有F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移。第二十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pBR322 改造而來(lái) 通過(guò) -互補(bǔ)作用形成的藍(lán)色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒第二十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ 的顯色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-

11、D-半乳糖苷 X-galabb-半乳糖苷酶的a-肽段PlacMCSlacZ第二十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月蘭-白斑篩選 如pUC質(zhì)粒含LacZ基因（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ基因不能表達(dá)，菌株呈白色，稱(chēng)之為藍(lán)-白斑篩選。第二十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PUC質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn):具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體具有多克

12、隆位點(diǎn)MCS區(qū)段第三十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月MCSlacZPT7PSP6oripGEM-3Z2743 bpApr注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等多拷貝多克隆位點(diǎn)正選擇顏色標(biāo)記lacZ具有兩個(gè)噬菌體強(qiáng)啟動(dòng)子用于外源基因的高效表達(dá)在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體第三十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月穿梭質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記,可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌-釀酒酵母

13、穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌-動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體第三十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（五）質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問(wèn)題質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分配到兩個(gè)子細(xì) 胞中1、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性:寄主基因組的IS序列插入質(zhì)粒、質(zhì)粒間的同源重組等都會(huì)使質(zhì)粒發(fā)生插入或缺失。2、分離的不穩(wěn)定性:在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)?？截?，并最終繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。（六）影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素 新陳代謝負(fù)荷;質(zhì)粒載體的拷貝數(shù) ;寄主菌的重組體系第三十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 二、噬菌體(bacter

14、iophage)載體高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞;自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體第三十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體一般生物學(xué)特性大多數(shù)多呈帶尾部的二十面體. 如 噬菌體,部分為線狀體型.如 M13噬菌體顆粒的外殼是蛋白質(zhì)分子,內(nèi)部是核酸,常見(jiàn)的是雙鏈DNA核酸相對(duì)分子量相差較大感染率極高生命周期可分為溶菌周期和溶源周期第三十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022

15、年6月（一）噬菌體的一般特性噬菌體的基本功能結(jié)構(gòu)及核酸類(lèi)型噬菌體的感染性溶菌周期溶源周期重組噬菌體的分離第三十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1 溶菌周期 感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。 2 溶源周期 感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化（lysogenization)。只有雙鏈DNA的噬菌體才有溶源周期.第四十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月溫和噬菌體:既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶源生命周期的噬菌體.溶源性細(xì)菌:具有一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌

16、.溶源化:用溫和的噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過(guò)程整合:噬菌體的DNA被包容在寄主細(xì)菌染色體DNA之中,便叫做已整合的噬菌體DNA原噬菌體:在溶源性細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體DNA,叫原噬菌體,原噬菌體中如有某些基因缺失了,稱(chēng)之為缺陷性的原噬菌體 lysogenicstate :噬菌體侵染宿主細(xì)胞后，將噬菌體基因組DNA通過(guò)位點(diǎn)專(zhuān)一性重組整合到宿主的染色體DNA中，并隨宿主的繁殖傳給子代細(xì)胞的現(xiàn)象稱(chēng)溶源狀態(tài)。 第四十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月溶源

17、細(xì)菌不能被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染. 抗御同種噬菌體再感染的特性叫做超感染免疫性.經(jīng)過(guò)許多世代之后,溶源性的細(xì)菌便能開(kāi)始進(jìn)入溶菌周期,這個(gè)過(guò)程叫做溶源性細(xì)菌的誘發(fā)溶源細(xì)菌有兩個(gè)重要特點(diǎn):第四十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）單鏈DNA噬菌體載體（M13）1、生物學(xué)特性2、M13克隆體系3、噬菌體展示載體第四十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生物學(xué)特性噬菌體的外型呈絲狀由外殼包裝蛋白和(+)DNA組成 基因組為單鏈DNA;不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)DNA上至少有10個(gè)基因不存在包裝限制。 M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌，但M13 DNA可以

18、轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌，顆粒內(nèi)含有長(zhǎng)6407 bp的閉合環(huán)狀DNA基因組。M13的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因組。M13通過(guò)細(xì)菌的纖毛插入大腸桿菌，單鏈分子作為模板合成互補(bǔ)鏈，形成雙鏈DNA分子。轉(zhuǎn)染:感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)分離出來(lái)的噬菌體核酸所感染，隨后能產(chǎn)生出正常噬菌體后代；感染:病原微生物在寄主組織內(nèi)立足的狀態(tài) 第四十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月復(fù)制型DNA(ReplicativeformDNA ):在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀

19、雙鏈DNA，用于DNA的復(fù)制，這種雙鏈DNA稱(chēng)為復(fù)制型DNA。 第四十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月M13載體的構(gòu)建 在M13基因組中有一段507個(gè)核苷酸區(qū)域的間隔序列,稱(chēng)為IS區(qū);在其間插入序列不受影響插入LacZ,編碼B-半乳糖苷酶前面146個(gè)氨基酸,含有其操縱基因和啟動(dòng)子區(qū),插入接頭第五十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月M13 DNA載體的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)有MCS，便于克隆不同的酶切片段 Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇無(wú)包裝限制，克隆能力大可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈 缺點(diǎn)插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降實(shí)際克隆能力小于1500bp第五十一張，PPT共

20、一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(三)、雙鏈?zhǔn)删w載體研究得最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體第五十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月l 噬菌體的生物學(xué)特性線狀雙鏈DNA分子l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成l-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸l-DNA上至少有61個(gè)基因兩端各有12bp的粘性末端 第五十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體線性DNA分子的粘性末端及其環(huán)化作用a.具有互補(bǔ)粘性的DNA分子b.通過(guò)粘性末端環(huán)化了的DNA分子粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱(chēng)為cos位點(diǎn) 第五十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞內(nèi)環(huán)化形式的野生型噬菌體

21、基因圖第五十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月野生型做為克隆載體的缺點(diǎn):限制性?xún)?nèi)切酶有較多的切割位點(diǎn)第五十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月l-DNA載體的構(gòu)建：去除非必需區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn) 野生型l-DNA有包裝限制，噬菌體的包裝能力控制在野生型的75%到105%（36-51kb）。必須區(qū)是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb 插入選擇標(biāo)記基因 cI失活，Spi篩選和LacZ藍(lán)白斑篩選建立重組DNA分子的體外包裝系統(tǒng)第五十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)切除的多少，可將l-DNA分成兩大類(lèi)載體：插入型載體取代型載體第五

22、十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月I、插入型載體具有一個(gè)限制酶位點(diǎn)可便于外源DNA插入的,其承受的外源DNA片段較小.一般在10K以?xún)?nèi)。廣泛用于cDNA及小片段DNA克隆。經(jīng)改造后的長(zhǎng)度為37kb，為包裝的下限，插入片段最大為14kb（51-37kb）如 gt10、gt11、BV2、NM540、NM1590、NM607第五十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月插入失活常包括免疫功能失活型 插入位點(diǎn)位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cI基因）內(nèi)，插入導(dǎo)致載體不能合成阻遏物， 載體DNA不能進(jìn)入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。沒(méi)有外源DNA插入的載體感染受體菌形成混

23、濁噬菌斑 如NM1149載體的兩個(gè)克隆位點(diǎn)（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因內(nèi)部 -半乳糖苷酶失活型載體 在基因組中引入了LacZ序列。（其上含有一個(gè)EcoR I 克隆位點(diǎn)）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，利用Xgal的顯色反應(yīng)作選擇標(biāo)記第六十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月替換型載體（substitution vectors) 兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)以反向重復(fù)形式分別位于DNA的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來(lái)，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換。如： EMBL4、Charon40等可取代片斷中如果包含LacZ，可用Xgal顯色作篩選標(biāo)

24、記替換型克隆外源DNA包括三個(gè)步驟:1.應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化噬菌體,除去基因組中可取代的DNA區(qū)段2.將上述所得的DNA臂同外源DNA片段連接3對(duì)重組體的DNA分子進(jìn)行包裝和增殖,以得到有感染性的重組噬菌體第六十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體載體一般用途 ：主要用于克隆 DNA 片段構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)和基因組文庫(kù)，并從中篩選目標(biāo)基因 亞克隆在大容量載體（如粘粒）中增殖的外源 DNA 片段第六十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月載體的體外包裝（1

25、）體外包裝 在試管中與噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細(xì)菌，把重組DNA注入受體菌中包裝過(guò)程:E 基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因的產(chǎn)物也是頭部蛋白，但主要與 DNA 進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（只占20%）。第六十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第六十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA載體的優(yōu)點(diǎn) -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 -DNA載體的裝載能力為23 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組 -DNA分子的篩選較為方便 -DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，不適合表達(dá)外源基因用在真核生

26、物基因組文庫(kù)的建立第六十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、柯斯質(zhì)粒載體1、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建2、柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)3、柯斯克隆4、柯斯克隆的改良第六十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月考斯質(zhì)粒與噬菌粒 -DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為23 kb和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體DNA的裝載量.在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體DNA的長(zhǎng)度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，同時(shí)又能保證重

27、組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當(dāng)然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。第六十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1 粘粒載體（考斯質(zhì)粒載體） 粘粒的結(jié)構(gòu)特征粘粒（cosmid）：一類(lèi)由人工構(gòu)建的含有 噬菌體 DNA的 cos 序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體 粘粒的組成 包括質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1），抗性標(biāo)記（ampr）， cos 位點(diǎn), 能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化（transform)和增殖(multiplication) 大?。?一般 5-7kb 左右，用來(lái)克隆大片段 DNA

28、，克隆的最大 DNA 片段可達(dá) 45kb 第七十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月考斯質(zhì)粒（cosmid）pHC796400bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalI三部分組成:一個(gè)抗藥性標(biāo)記和一個(gè)質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)帶有 -DNA cos序列;一個(gè)或多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)裝載范圍為31 - 45 kb第七十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解

29、受體細(xì)胞第七十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、粘粒載體的工作原理分離外源DNA片斷35-45kb外源DNA與兩個(gè)粘粒相連，且cos方向相同體外包裝： 噬菌體 A 基因蛋白的末端酶功能作用下切割兩個(gè) cos 位點(diǎn)，并將兩個(gè)同方向 cos 位點(diǎn)之間的片段包裝到 噬菌體顆粒中去 線狀的重組 DNA 注入細(xì)胞并通過(guò) cos 位點(diǎn)環(huán)化，形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復(fù)制并使其宿主獲得抗藥性。第七十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用途在構(gòu)建基因文庫(kù)中，減少重組體的數(shù)目在單個(gè)重組體中克隆和增殖完整的基因克隆與分析組成某一基因

30、家族的真核DNA區(qū)段在染色體步查（chromosome walking) 過(guò)程中具有優(yōu)勢(shì)，是 噬菌體 文庫(kù)的兩倍，可克隆45kb 染色體步查：采用一段分離自某一重組體一端的非重復(fù)DNA片段作探針，以鑒定含有相鄰序列的重組克隆第七十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月cosmid載體克隆的缺點(diǎn)載體片斷自我連接外源DNA片斷自我連接多個(gè)本來(lái)不在一起的外源DNA片斷連接起來(lái)同時(shí)插入載體第七十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月cosmid載體的改良 pJB8 cosmid載體 在BamH I位點(diǎn)兩側(cè)各有一個(gè)EcoR I切點(diǎn)。使克隆在BamH I上的外源DNA可被EcoR I切

31、下來(lái)。第七十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、噬菌粒載體1、概念2、pUC118和 pUC1193、pBluescript噬菌粒載體第七十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月概念 由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型噬菌粒載體系列能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb）通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易第七十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118 pUC18

32、+ M13間隔區(qū) IGpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū) IG重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體由pUC質(zhì)粒載體、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和T3、T7噬菌體的啟動(dòng)子組成。 MCS兩側(cè)分別加上T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子。加入適當(dāng)?shù)氖删wRNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄第八十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌粒具有以下特征 雙鏈 DNA 既穩(wěn)定，又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征； 免卻了將外源 DNA 片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一既繁瑣又費(fèi)時(shí)的步驟； 由于

33、載體足夠小，故可得到長(zhǎng)達(dá) 10kb 的外源 DNA 區(qū)段的單鏈。第八十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月噬菌粒的主要優(yōu)點(diǎn)： 可以產(chǎn)生大段外源 DNA 的適量單鏈拷貝，又不必?fù)?dān)心發(fā)生缺失突變，而這些外源 DNA 區(qū)段常常由于太大而不能克隆于常規(guī) M13 載體。缺點(diǎn)： 輔助噬菌體感染后，有時(shí)候單鏈 DNA 的產(chǎn)量較低且重復(fù)性較差。第八十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、大分子DNA克隆載體 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體它能像天然染色體那樣

34、，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC)第八十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1 酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體 生長(zhǎng)的代時(shí)為 90 分鐘；含 16 條染色體，其大小為 225-1900kb ，總計(jì)有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性 第八十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月YAC載體應(yīng)含有下列元件控制酵母DNA復(fù)制的自主復(fù)制序列（auton

35、omously replication sequences，ARS） 一段來(lái)自酵母染色體的著絲粒（centromere ， CEN）序列； 有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中 一對(duì)酵母的端粒重復(fù)序列 定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的 DNA 不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu) 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記：trp 1、 leu 2 ，his 3 ，ura3 ，sup4 宿主酵母菌 ade 2-1 ade 2-1 ，sup4 白色菌落 ade 2-1 紅色菌落YAC載體的裝載量為:350 - 400 kb第八十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

36、月第八十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第八十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月缺點(diǎn)存在高比例的嵌合體，一個(gè)克隆含兩個(gè)不相連的獨(dú)立片段；部分克隆子不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會(huì)發(fā)生缺失或重排；難與酵母染色體區(qū)分開(kāi)，因?yàn)閅AC與酵母染色體有相似結(jié)構(gòu)；操作時(shí)容易發(fā)生染色體機(jī)械切割。第九十張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2 細(xì)菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間.各種類(lèi)型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝

37、.主要適用于：克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu);構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù); 克隆大片段DNA，100-300kb第九十一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)構(gòu)特征一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記:氯霉素抗性和 Lac Z 一個(gè)來(lái)源于大腸桿菌 F 因子的復(fù)制子 oriS(嚴(yán)謹(jǐn)型控制)一個(gè)易于 DNA 復(fù)制的的解旋酶（RepE）(由 ATP 驅(qū)動(dòng))三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和parC ） 。 第九十二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第九十三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點(diǎn)易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli（效率比酵

38、母高10-100倍）；超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；F質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復(fù)制；很少發(fā)生體內(nèi)重排。低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。缺點(diǎn):拷貝數(shù)小,制備難度大第九十四張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達(dá)載體可攜帶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯的載體,一般在克隆載體基礎(chǔ)上增加了基因表達(dá)的調(diào)控元件.質(zhì)粒表達(dá)載體病毒表達(dá)載體大片段表達(dá)載體其他第九十五張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒表達(dá)載體以質(zhì)粒為基本骨架和克隆載體的基礎(chǔ)上,組裝啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄終止子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)等表達(dá)元件而構(gòu)建成的.原核表達(dá)載體T

39、i質(zhì)粒表達(dá)載體動(dòng)物質(zhì)粒表達(dá)載體第九十六張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月(一) 原核表達(dá)載體啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)1表達(dá)元件主要包括:啟動(dòng)子:trp-lac（tac）啟動(dòng)子、噬菌體PL啟動(dòng)子、T7噬菌體啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn):核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）,起始密碼子（ATG）和SD序列用途：表達(dá)外源目的基因，獲得重組融合蛋白第九十七張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2 表達(dá)方式:組成型表達(dá):在組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，外源基因源源不斷地表達(dá)。誘導(dǎo)型表達(dá)：表達(dá)受一些因素的誘導(dǎo)，屬于可控性表達(dá)。融合型表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽，表達(dá)為融合

40、蛋白，可方便后續(xù)的蛋白分離純化和檢測(cè)。分泌型表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入一個(gè)信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，可避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，或形成包含體，且表達(dá)產(chǎn)物是可溶性的，不需要重復(fù)。典型的原核表達(dá)載體pET-12a第九十八張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌原核細(xì)胞表達(dá)1） 表達(dá)載體：較常用的是具可誘導(dǎo)的T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體，大部分蛋白可獲得表達(dá)而且表達(dá)量較高 （占細(xì)菌總蛋白的25%以上）。2） 寄主菌：細(xì)菌染色體上含有噬菌體T7-RNA聚合酶基因，它的啟動(dòng)子為L(zhǎng)ac啟動(dòng)子，可被IPTG誘導(dǎo)3） 融合蛋白：常用6-10組氨酸-融合蛋白，只增加幾

41、個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響較少。 GST-融合蛋白，選擇大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，易表達(dá)外源蛋白。融合蛋白有利于表達(dá)和純化。4） 用途：獲得融合蛋白，用于抗體制備，生化性質(zhì)研究等。 第九十九張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由于原核生物和真核生物存在糖基化,?；确g后修飾反應(yīng)機(jī)制的差異,真核基因的原核表達(dá)難以獲得有活性的蛋白,酵母成為真核表達(dá)的首選系統(tǒng).多數(shù)從pBR322基本骨架衍生而來(lái).多數(shù)為穿梭載體（二）酵母表達(dá)載體第一百?gòu)?，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）Ti質(zhì)粒載體是根癌農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的可引發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤的質(zhì)粒.雙鏈環(huán)狀DNA分子，150250Kb,獨(dú)立復(fù)制類(lèi)

42、型：章魚(yú)堿型和胭脂堿型第一百零一張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TDNA區(qū)、毒性區(qū)（Vir區(qū)）、質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)和冠癭堿分解位點(diǎn)第一百零二張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月TDNA的整合過(guò)程土壤農(nóng)桿菌植物DNA轉(zhuǎn)移體系有5個(gè)步驟：植物敏感細(xì)胞和土壤農(nóng)桿菌的相互作用；土壤農(nóng)桿菌的毒性區(qū)基因激活；TDNA的切割和T復(fù)合物的生成；T復(fù)合物由土壤農(nóng)桿菌經(jīng)植物細(xì)胞膜進(jìn)入植物細(xì)胞核的過(guò)程；TDNA整合到植物染色體的過(guò)程。 第一百零三張，PPT共一百一十八頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目前常用的兩種載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng) 共整合載體系統(tǒng)(一元載體系統(tǒng)) 第一百零四張，PPT共一