2021屆蘇高中生物競賽實(shí)驗(yàn)輔導(dǎo)講義-生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(基礎(chǔ))02菜花(花椰萊)中核酸的分離和鑒定

1、2021屆高中生物競賽實(shí)驗(yàn)輔導(dǎo)講義生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（基礎(chǔ)部分）x.*h實(shí)驗(yàn)二菜花（花椰萊）中核酸的分離和鑒定一、目的初步掌握從菜花中分離核酸的方法，和RNA、DNA的定性檢定。二、原理用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子等物質(zhì)。再用有機(jī)溶劑，如乙醇、乙醇等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物質(zhì)。最后用濃鹽溶液（10%氯化鈉溶液）和0.5摩爾/升高氯酸（70C）分別提取DNA和RNA,再進(jìn)行定性檢定。由于核糖和脫氧核糖有特殊的顏色反應(yīng)，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)的顏色深淺在一定范圍內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比，因此可用定糖法來定性定量測定核酸。核糖的測定：測定核糖的常用方法

2、是苔黑酚（即3,5-二羥甲苯）法（Oreinol反應(yīng)）。當(dāng)含有核糖的RNA與濃鹽酸及3,5-二羥甲苯在沸水浴中加熱l（1020分鐘后，有綠色物產(chǎn)生，這是因?yàn)镽NA脫瞟吟后的核糖與酸作用生成糠醛，后者再與3,5-二羥甲苯作用產(chǎn)生綠色物質(zhì)。CHSRNA+濃鹽酸+hoJQLoh誥*録色復(fù)合物DNA、蛋白質(zhì)和粘多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。脫氧核糖的測定：測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的DNA在酸性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱10分鐘后，產(chǎn)生藍(lán)色。這是因?yàn)镈NA嘌吟核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成s-羥基-6-酮基戍醛，它再和二苯胺作用產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。NHUNA+少童濃HZSO.+凹匚藍(lán)色物此法

3、易受多種糖類及其衍生物和蛋白質(zhì)的干擾。上述兩種定糖的方法準(zhǔn)確性較差，但快速簡便，能鑒別DNA與RNA,是檢定核酸、核昔酸的常用方法。三、器材1.恒溫水浴。2電爐。離心機(jī)。布氏漏斗裝置吸管。燒杯。量筒。剪刀。四、試劑和材料1.新鮮菜花。2.95乙醇600毫升3.丙酮400毫升4.5高氯酸溶液200毫升5.0.5摩爾升高氯酸溶液200毫升6.10氯化鈉溶液400毫升7.標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液（5毫克/100毫升）50毫升8.標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液（15毫克/100毫升）50毫升二苯胺試劑將1克二苯胺溶于100毫升冰醋酸中，再加人2.75毫升濃硫酸（置冰箱中可保存6個(gè)月。使用前，在室溫下?lián)u勻）。三氯化鐵濃鹽酸溶液將

4、2毫升10%三氯化鐵溶液（用FeC136H2O配制）加人到400毫升濃鹽酸中。苔黑酚乙醇溶液溶解6克苔黑酚于100毫升95%乙醇中（可在冰箱中保存1個(gè)月）五、操作步驟：1.核酸的分離（1）取萊花的花冠20克，剪碎后置于研體中。加人20毫升95%乙醇和400毫克海沙，研磨成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，并去濾液。（2）濾渣中加人20毫升丙酮，攪拌均勻，抽濾，棄去濾液。（3）再向?yàn)V渣中加人20毫升丙酮，攪拌5分鐘后抽干（于力壓濾渣，盡量除去丙酮）。（4）在冰浴中，將濾渣懸浮在預(yù)冷的20毫升5%高氨酸溶液中。攪拌，抽濾，棄去濾液。（5）將濾渣懸浮于20毫升95%乙醇中，抽濾，棄去濾液。（6）濾渣中加人2

5、0毫升丙酮，攪拌5分鐘。抽濾至干，用力壓濾渣盡量除去丙團(tuán)。（7）將干燥的濾渣重新懸浮在40毫升10%氯化鈉溶液中。在沸水浴中加熱15分鐘。放置，冷卻，抽濾至干，留濾液。并將此操作重復(fù)進(jìn)行一次。將兩次濾波合并，為提取物一。（8）將濾渣重新懸浮在20毫升0.5摩爾/升高氨酸溶液中。加熱到70”C。保溫20分鐘（恒溫水浴）后抽濾。留濾液（提取物二）。2RNA,DNA的定性鑒定(1)二苯胺反應(yīng)：操作項(xiàng)目管號(hào)12345蒸餾水(ml)10000DNA溶液(ml)01000RNA溶液(ml)00100提取物一(ml)00010提取物二(ml)00001二苯胺試劑(ml)22222沸水浴中加熱10min后觀察現(xiàn)象2)苔酚反應(yīng)操作項(xiàng)目管號(hào)12345蒸餾水(ml)10000DNA溶液(ml)01000RNA溶液(ml)00100提取物一(ml)00010提取物二(m