齊魯醫(yī)學(xué)HGPRT-、TK-雜交瘤細(xì)胞Ig-、HGPRT

1、分子生物學(xué)實(shí)用技術(shù)抗 體 技 術(shù) 李 官 成 中南大學(xué)腫瘤研究所 2012-5-712021/10/23 星期六22021/10/23 星期六免疫學(xué)的科學(xué)早期 (19世紀(jì)中葉-1912年) 血清療法： 1890年德國的貝林(Emil von Behring)和同事日本學(xué)者北里柴三郎(Kitasato)用白喉及其破傷風(fēng)外毒素免疫動(dòng)物，所獲得動(dòng)物血清可中各或破壞其毒素作用，并且可預(yù)防由毒素所導(dǎo)致疾病的發(fā)生。隨后，被稱之為“抗血清”。貝林 E.,Behring1854-19171901年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)32021/10/23 星期六埃利希. P. (Paul Ehrlich, 1854-191

2、5)德國細(xì)菌學(xué)家、免疫學(xué)家 1908年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 最早用化學(xué)反應(yīng)解釋免疫過程。第一個(gè)定量地研究了毒素與抗毒素的沉淀反應(yīng)，建立起抗體理論。由于他的研究，后來科學(xué)家才開始使用“免疫化學(xué)”這個(gè)名詞，因此他被譽(yù)為免疫化學(xué)的先驅(qū)。42021/10/23 星期六埃德爾曼.G.M. (Gerald Maurice Edelman, 1929-)美國生物化學(xué)家 1972年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 主要闡明了抗體分子結(jié)構(gòu)，對生物化學(xué)和免疫學(xué)研究作出了重大貢獻(xiàn)。 1969年4月，在美國實(shí)驗(yàn)生理學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)第53次年會(huì)上，Edelman正式宣布：自己已解決抗體分子最詳盡的化學(xué)結(jié)構(gòu)即其氨基酸序列問題。與會(huì)者

3、一致認(rèn)為：這項(xiàng)研究成果“是解決抗體分子三維結(jié)構(gòu)問題至關(guān)重要的一個(gè)步驟，是一項(xiàng)重大成就，它必將對進(jìn)一步了解抗體的功能發(fā)揮巨大的作用。52021/10/23 星期六波特. R.R. (Rodney Robert Portel, 1917-1986)英國生物化學(xué)家 1972年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 首次提出抗體四肽鏈結(jié)構(gòu)，為闡明 抗體的結(jié)構(gòu)和它的特異性之間的貢 獻(xiàn)，提供了極重要的證據(jù)。 是分子免疫學(xué)的創(chuàng)始人之一。 是Fc、Fab和重鏈與輕鏈的發(fā)現(xiàn)者。62021/10/23 星期六 因開發(fā)了放射免疫分析法，1977年獲得諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 發(fā)現(xiàn)在用胰島素治療糖尿病時(shí)，可使機(jī)體產(chǎn)生抗胰島素的抗體。但

4、是這一重要研究成果開始并未得到大家的承認(rèn)，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為象胰島素這樣的小分子并不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。柏森（1972年逝世）和Yalow接著研究發(fā)現(xiàn)，向免疫復(fù)合物（由標(biāo)記的胰島素及其相應(yīng)抗體形成）中加入過量的未標(biāo)記胰島素時(shí)可使部分的胰島素被取代。雅洛. R. (Rosalyn Yalow, 1921-2011)美國物理學(xué)家 1977年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)72021/10/23 星期六 研究病毒學(xué)和免疫學(xué)的專家 是世界上研究流行性感冒、白血病和病毒性疾病的權(quán)威。提出了間接模板學(xué)說和獲得性免疫的無性繁殖系選擇學(xué)說，對于臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)及分子遺傳學(xué)具有極其重要的意義。 在免疫學(xué)理論上的建樹是十分巨大的

5、，他的理論假說對后繼免疫學(xué)研究產(chǎn)生了深遠(yuǎn)而重大影響。在免疫學(xué)理論上，目前尚未見比他起到更大歷史影響作用的研究者。伯內(nèi)特. F.M. (Frank Macfarlane Burnet, 1899-1985)澳大利亞免疫學(xué)家 1960年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)82021/10/23 星期六 他與與著名生物化學(xué)家米爾斯坦共同研究開發(fā)出一套制備單克隆抗體的新技術(shù)，被譽(yù)為上世紀(jì)70年代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)革命。 他們1973年開始研究單克隆抗體。1975在英國劍橋醫(yī)學(xué)研究會(huì)研究出一種新技術(shù)，可使鼠細(xì)胞與人類細(xì)胞融合，產(chǎn)生一種被稱為“雜交瘤”的細(xì)胞。對這種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，即可產(chǎn)生大量抗感染的抗體。

6、科勒. G. (Georges Kohler, 1946-1996)德國免疫學(xué)家 1984年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)92021/10/23 星期六 1975年他們將適應(yīng)于組織培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠的脾細(xì)胞融合，獲得了能分泌與免疫原起反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞株。這種雜交瘤細(xì)胞株既有骨髓瘤細(xì)胞的永生性（能在組織培養(yǎng)中大量增殖），又能分泌大量的單克隆抗體。米爾斯坦. C. (Cesar Milstein, 1927-)生物化學(xué)家（英國和阿根廷雙重國籍）1984年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)102021/10/23 星期六是現(xiàn)代免疫學(xué)之父，為現(xiàn)代免疫學(xué)的建立奠定了基礎(chǔ)。 提出了三個(gè)學(xué)說： 抗體形成的“天

7、然”選擇學(xué)說； 有關(guān)抗體多樣性發(fā)生的學(xué)說； 免疫系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)學(xué)說。杰尼. N.K. (Niels K. Jerne, 1911-)丹麥免疫學(xué)家 1984年獲諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)112021/10/23 星期六 一、抗體相關(guān)理論122021/10/23 星期六抗體（antibody, Ab） 機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細(xì)胞-漿細(xì)胞合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。132021/10/23 星期六（一）抗體的發(fā)現(xiàn)早在19世紀(jì)后期，Behring和Kitasato就發(fā)現(xiàn)用白喉或破傷風(fēng)毒素免疫動(dòng)物后產(chǎn)生一種可以中和毒素的物質(zhì)，稱之為抗毒素（antitoxin

8、）。后引入“抗體”一詞泛指抗毒素類物質(zhì)。1939年Tiselius和Kabati證實(shí)抗體為球蛋白。1968年和1972年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)的專門委員會(huì)先后決定：將具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。免疫球蛋白可分為分泌型（secreted Ig, SIg）膜型（membrane Ig, mIg）兩種。Sig存在于備注及組織洲中，具有抗體的各種免疫功能；mIg是B細(xì)胞表面的抗原受休。142021/10/23 星期六抗體生成理論 1897年 側(cè)鏈學(xué)說 1930年 模板學(xué)說 1941年 間接模板學(xué)說 1955年 自然選擇學(xué)說

9、 1958年 克隆選擇學(xué)說152021/10/23 星期六（二）抗體的結(jié)構(gòu)(1) 重鏈（heavy chain，H） 2條 輕鏈（light chain，L） 2條(2) 可變區(qū)（variable region, V區(qū)） 恒定區(qū)（constant region, C區(qū)）(3) 超變區(qū)（ hyper-variable region, HVR), 又稱互補(bǔ)決定區(qū)(complementary determining region, CDR） 骨架區(qū)（framework region, FR）(4) 鉸鏈區(qū)（hinge region）162021/10/23 星期六172021/10/23 星期六可變

10、區(qū)恒定區(qū)（Variable and constant regions）182021/10/23 星期六Hypervariable region, HVR (1, 2, 3) (高可變區(qū))Framement region, FR (1,2,3,4) (骨架區(qū))Complementarity determining region, CFR (1,2,3) (互補(bǔ)決定區(qū))Antigen-binding site (抗原結(jié)合部位)192021/10/23 星期六（三）抗體的功能區(qū) Ig的多肽鏈分子可折疊成幾個(gè)由鏈內(nèi)二硫鍵連接的球形結(jié)構(gòu)，每個(gè)球形結(jié)構(gòu)由約110個(gè)氨基酸殘基組成，并代表一個(gè)功能區(qū)。2020

11、21/10/23 星期六212021/10/23 星期六（四）抗原抗體結(jié)合的基礎(chǔ) 抗體對抗原的結(jié)合是一種典型的特異性免疫結(jié)合，抗體結(jié)合抗原的部位位于Fab片段可變區(qū)結(jié)構(gòu)域中的CDR區(qū)。222021/10/23 星期六232021/10/23 星期六（五）抗體基因的遺傳控制完整的抗體分子由輕鏈（包括和）基因和重鏈基因編碼。 編碼一條免疫球蛋白多肽鏈的基因是由胚系中分隔開的基因片段經(jīng)重排而形成的。即免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)是由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中，這兩個(gè)基因因?yàn)榘l(fā)生易位而重排在一起形成編碼完整免疫球蛋白分子的基因。242021/10/23 星期六 免疫球蛋白基因的染色體定

12、位 人 鼠 重 鏈 14q32 12F1 kappa 鏈 2p12 6c2 lambda鏈 22q11 16252021/10/23 星期六重鏈可變區(qū)基因的重排262021/10/23 星期六鏈基因的重排272021/10/23 星期六鏈基因的重排 282021/10/23 星期六（六）抗體多樣性機(jī)制（1）編碼Ig基因的多樣性（2）體細(xì)胞突變（3）V、D、J基因連接的多樣性（4）H鏈和L鏈相互隨機(jī)配對292021/10/23 星期六 二、抗體技術(shù)302021/10/23 星期六抗體的產(chǎn)生有三種條途徑：經(jīng)典途徑：即免疫動(dòng)物產(chǎn)生多克隆抗體（抗 血清）；細(xì)胞工程途徑：即運(yùn)用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克 隆抗體

13、；利用基因工程途徑表達(dá)和改造抗體。312021/10/23 星期六抗體種類：第一代抗體：多克隆抗體 polyclonal antibody第二代抗體：單克隆抗體 monoclonal antibody第三代抗體：基因工程抗體 genetic engineering antibody322021/10/23 星期六（一）B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體克?。杭?xì)胞集落單克隆：一個(gè)無性繁殖細(xì)胞集落單克隆抗體：一個(gè)B細(xì)胞無性繁殖所產(chǎn)生的抗體 特點(diǎn)：一種抗體，性質(zhì)、結(jié)構(gòu)均一雜交瘤：淋巴細(xì)胞+骨髓瘤細(xì)胞=融合=雜交瘤細(xì)胞 特點(diǎn)：繼承淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體 繼承瘤細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)332021/10/23 星期

14、六342021/10/23 星期六1.免疫原和免疫程序(1)顆粒性抗原：細(xì)胞、微生物等 表面抗原一般有較高的免疫原性，不加佐劑。如細(xì)胞抗原一般以1-2 107 細(xì)胞腹腔注射。(2)可溶性抗原：蛋白質(zhì)類 一次劑量為10-100ug，需加佐劑。352021/10/23 星期六(3) 弱抗原：多肽、糖類、類固醇等 與蛋白交聯(lián)，如白蛋白、KLH等(4) 微量抗原：常采用特殊的免疫方法 體外免疫 10-100ng/ml 脾內(nèi)一次注射 20ug(蛋白抗原)， 2.5 105 (細(xì)胞)程序： 常規(guī) 0、21、42天免疫，52天試血， 融合前3天加強(qiáng)免疫 快速 0、14、28天免疫，38天試血， 融合前3天加

15、強(qiáng)免疫362021/10/23 星期六372021/10/23 星期六McAb and PcAb382021/10/23 星期六McAb與PcAb的比較McAbPcAb抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低穩(wěn)定性低高沉淀反應(yīng)無有成本高低392021/10/23 星期六2.培基的配制基礎(chǔ)培基：DMEM RPMI1640選擇性培基：HAT培基谷氨酰胺、丙酮酸鈉血清：小牛血清（需篩選）完全培基402021/10/23 星期六3. 融合用細(xì)胞（1）骨髓瘤細(xì)胞不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同 種類：小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 無Ig 缺乏HGPRT NS-1 k

16、缺乏HGPRT 大鼠骨髓瘤細(xì)胞 Y3-Ag1.2.3 抗體得量較高 人骨髓瘤細(xì)胞 SK007 培養(yǎng)技術(shù)較困難412021/10/23 星期六培養(yǎng) 選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代和融合 細(xì)胞106/ml 細(xì)胞老化 避免返祖：返祖即重新獲得HGPRT 細(xì)胞用15-20ug/ml 8-氮鳥嘌呤處理 不要過多傳代422021/10/23 星期六（2）免疫脾細(xì)胞目的 取得分裂活躍并能產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞，增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤頻率。來源 A. 小鼠脾臟：Balb/c 8-12周齡 B. 大鼠脾臟： C. 人：外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)、扁桃體432021/10/23 星期六（3）飼養(yǎng)細(xì)胞 定義 能夠

17、支持其它細(xì)胞生長的細(xì)胞。來源 A. 小鼠的腹腔細(xì)胞 B. 大鼠的胸腺細(xì)胞 作用 A. 產(chǎn)生非種屬特異性生長因子 B. 吞噬壞死細(xì)胞442021/10/23 星期六4. 細(xì)胞融合(1)方法 A. PEG法 B. 自發(fā)觸發(fā) C. 仙臺病毒 D. 受體指引法 E. 電融合法 F. 激光法 G. 磁場融合452021/10/23 星期六(2)整個(gè)過程A.飼養(yǎng)細(xì)胞的制備(融合前一天) 小鼠 消毒固定 暴露腹膜 注入Hanks 按摩 抽出 無血清培基洗一次 計(jì)數(shù)(2105 /ml) B.骨髓瘤細(xì)胞 復(fù)蘇(前7天 ) 擴(kuò)增 收集細(xì)胞(對數(shù)生長期) 計(jì)數(shù)及活力測定(活率 95%，總數(shù) 10 7 )462021

18、/10/23 星期六C.免疫脾細(xì)胞的制備加強(qiáng)免疫后3-4天免疫鼠 眼框放血 血清供檢測用 處死消毒，無菌取出脾臟 制備單細(xì)胞懸液 50ml離心管靜止5-10分鐘 吸上清于另一50ml離心管，1000rpm，10分鐘 計(jì)數(shù)，活力測定。472021/10/23 星期六D. PEG作用機(jī)理：使細(xì)胞膜脂類分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生重排， 細(xì)胞膜容易被打開，最終引起細(xì)胞融合。作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG， 其純度與毒性有所不同MW：600，1000，1500，4000，6000 MW 融合率 細(xì)胞毒性 配制：PEG，8磅15分鐘；50 時(shí)加等量無血清培基(50%,W/V)。 30% 融合率

19、低 50% 毒性 482021/10/23 星期六E.細(xì)胞融合a.試劑、培基，37水浴。b.脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞混合，1-10：1。c.1000rpm，10分鐘。d.輕彈離心管底部，使兩種細(xì)胞充分混勻成糊狀。e.加50%PEG 0.5ml (在37水浴中、邊加邊輕彈、1分鐘內(nèi)加完）。f.靜置90秒(37水浴)。g.滴加15ml無血清DMEM(37預(yù)熱)，2分鐘內(nèi)加完。h.1000rpm，10分鐘，棄上清。i.加完全培基或HAT培基，調(diào)整細(xì)胞濃度5 105 /ml。j.加入含飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板，每孔0.1ml。492021/10/23 星期六5.選擇性培養(yǎng)(1)目的 脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞

20、(2) 原理 HGPRT酶與TK酶： 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶 胸腺嘧啶核苷激酶502021/10/23 星期六HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T (Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNA512021/10/23 星期六 核酸合成途徑 HGPRTH 主要合成途徑糖、氨基酸 DNA A阻斷T TK522021/10/23 星期六 PEG 脾細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞Ig+、HGPRT+、TK+ Ig-、HGPRT-、TK+ 雜交瘤細(xì)胞 Ig+、HGPRT+、TK+ HA

21、T 7天死亡 HAT 死亡 存活532021/10/23 星期六(3)方法 A. 換液：2-3天換一次（半量換液） 7天內(nèi)：HAT 7-14天：HT 14天后：完全培基 B. 觀察542021/10/23 星期六 脾細(xì)胞 SP2/0 飼養(yǎng)細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞0天 良好 良好 良好 可見融合細(xì)胞1-2天 開始死亡 銳減 良好 成2-3個(gè)亮細(xì)胞3-4天 大部死亡 幾乎完全死亡 良好 成簇3-5, 10個(gè)細(xì)胞5-7天 死亡 死亡 變性 100 細(xì)胞成小島7-14天 1/3-1/5孔底552021/10/23 星期六6.雜交瘤細(xì)胞的篩選(1)選擇篩選方法的原則 A. 快速簡便 B. 敏感性高 C. 特異性

22、好 D. 方法穩(wěn)定(2)步驟 A.篩出能分泌與預(yù)定抗原起反應(yīng)的單抗 的雜交瘤細(xì)胞 B.篩出有預(yù)定特異性的雜交瘤細(xì)胞 C.篩出可供實(shí)際應(yīng)用，具有穩(wěn)定生長和 功能特性的均一后代的克隆562021/10/23 星期六(3)方法 常用的方法：固相放射免疫測定 固相酶免疫測定 免疫熒光技術(shù) 間接血凝試驗(yàn) 微量細(xì)胞毒試驗(yàn) 斑點(diǎn)試驗(yàn)572021/10/23 星期六ELISA582021/10/23 星期六。免疫熒光法592021/10/23 星期六7.克隆化(1)目的 選育出穩(wěn)定而同源的細(xì)胞系，淘汰遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞。(2)方法 有限稀釋法 顯微操作法 軟瓊脂平板法 細(xì)胞選分儀法602021/10/23

23、 星期六有限稀釋法特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方法：細(xì)胞懸液通過系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.51個(gè)細(xì)胞612021/10/23 星期六FACS：效率最高價(jià)格昂貴622021/10/23 星期六有限稀釋法(1)含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板。(2)陽性克隆稀釋成50、10、5細(xì)胞/ml。例：假定細(xì)胞濃度為3.5 10 5細(xì)胞/ml 0.1ml+培基3.4ml 10 4細(xì)胞/ml A A0.1ml+培基9.9ml 10 2細(xì)胞/ml B B1.0ml+培基1.0ml 50細(xì)胞/ml C C1.0ml+培基9.0ml 10細(xì)胞/ml D D2.0ml+培基2.0ml 5細(xì)胞/ml E63

24、2021/10/23 星期六(3)每3-5天換培基一次。換培基前，先觀察每孔中有無細(xì)胞“集落”？是一個(gè)還是多個(gè)？作出標(biāo)記。(4)7-9天后，細(xì)胞克隆長至孔底的1/3-1/2時(shí)，取上清進(jìn)行篩選，檢測有無特異性抗體存在。(5)陽性孔轉(zhuǎn)種24孔細(xì)胞板擴(kuò)增，及時(shí)檢測、做第二次有限稀釋、凍存。642021/10/23 星期六8.凍存和復(fù)蘇1.凍存（1）目的：保證細(xì)胞不致因傳代污染而丟失 避免多次傳代發(fā)生變異丟失染色體 防止非分泌細(xì)胞的過度生長 防止細(xì)胞密度過高而死亡652021/10/23 星期六（2）方法：液氮保存（-196 ） 配制方案：雜交瘤細(xì)胞（15）x106/ml) + 細(xì)胞凍存 液(30%

25、40% 牛血清，50%60% RPMI- 1640培養(yǎng)液，10%DMSO ) 分裝 “慢凍”：分步冷凍，30-70液氮 2.復(fù)蘇 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、 復(fù)蘇662021/10/23 星期六9.污染和控制污染的微生物主要有： 細(xì)菌、酵母菌、霉菌、支原體等。預(yù)防：(1)培基中加適當(dāng)濃度的抗生素。 (2)器皿消毒徹底，無菌操作嚴(yán)格。 (3)環(huán)境減少空氣對流。處理：對重要的雜交瘤細(xì)胞污染后的挽救。672021/10/23 星期六10.單抗的制備(1)決定抗體產(chǎn)生的因素 Y=A C V每個(gè)細(xì)胞的抗體產(chǎn)量A 一般：75-600個(gè)抗體分子/細(xì)胞/秒 鼠-鼠：50ug/ml 人

26、-鼠：5-25ug/ml 人-人：0.25-10ug/ml產(chǎn)生抗體的細(xì)胞濃度C 取決于總的細(xì)胞濃度及分泌抗體細(xì)胞的%。682021/10/23 星期六（2）體內(nèi)產(chǎn)生單抗A. 小鼠預(yù)處理： 石蠟油、降植烷等，腹腔注射。B. 攻瘤： 預(yù)處理1周-2月內(nèi)，用雜交瘤細(xì)胞攻擊。 510 5 -10 6/ 只。C. 采集腹水： 7-10天，小鼠腹部脹大，用注射器抽取腹水， 5-8ml/次，離心取上清，分裝保存。692021/10/23 星期六腹腔注射法702021/10/23 星期六（3）體外產(chǎn)生單抗A.含血清培養(yǎng)法 a. 靜止培養(yǎng)法：10-50ug/ml b. 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法：100ug/ml c. 中空纖

27、維：5mg/mlB.無血清培養(yǎng)法優(yōu)點(diǎn)：節(jié)約血清、不要純化、減少過敏反應(yīng)。成分：基礎(chǔ)培基（DMEM/RPMI1640） 血清替代因子（激素、生長因子，結(jié) 合蛋白，貼壁因子，微量元素等）712021/10/23 星期六(4) 新培養(yǎng)方法 A. 牛淋巴液體外循環(huán)培養(yǎng)法 B. 微囊培養(yǎng)法 C. DNA重組的細(xì)菌發(fā)酵法722021/10/23 星期六11.單抗的特性和純化(1)理化性質(zhì) 單抗IgG 多抗IgG56 30min 完全失活 有活性63 1hr內(nèi) 10min內(nèi)聚合 不被PEG沉淀 30min沉淀pH pH6-8穩(wěn)定 pH6-10穩(wěn)定 pH8不穩(wěn)定IEF電泳分析 三條區(qū)帶 20+條732021/

28、10/23 星期六(2) 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性高 （2）均一性 （3）可重復(fù)性 （4）永生性 （5）效價(jià)高缺點(diǎn)：（1）太單一，對熱、pH不穩(wěn)定 （2）半衰期較短 （3）可能含有病毒742021/10/23 星期六(3)純化單抗的純花取決于實(shí)際應(yīng)用的要求和單抗的類型。1.初步：硫酸銨沉淀法2.IgG：正辛酸法、SPA親和層析法、DEAE離子交換層析法等。3.IgM：羥基磷灰石柱層析、SephadexG-200 、SephacrylS-300等。752021/10/23 星期六鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化762021/10/23 星期六（二）基因工程抗體 基因工程（genetic

29、 engineering antibody）抗體興起于80年代對鼠源性單克隆抗體（McAb）的人源化改造。 這一技術(shù)是將對Ig基因結(jié)構(gòu)與功能的了解與DNA重組技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)研究者的意圖采用基因工程方法，在基因水平對Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，甚至是人工全合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體，也稱為第三代抗體。 772021/10/23 星期六基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)與單克隆抗體相比，基因工程抗體具有如下優(yōu)點(diǎn)：通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)。基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位。根據(jù)治療的需要，制備新型抗體?？梢圆?/p>

30、用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子大大降低生產(chǎn)成本。782021/10/23 星期六基因工程抗體制備的基本步驟 1. Ig可變區(qū)基因的克隆 2. 抗體基因的修飾及表達(dá)載體的構(gòu)建 3. 抗體基因的表達(dá)與篩選鑒定792021/10/23 星期六基因工程抗體分類嵌合抗體改型抗體 基本類型小分子抗體噬菌體抗體催化抗體抗原化抗體雙特異性抗體抗體融合蛋白胞內(nèi)抗體802021/10/23 星期六812021/10/23 星期六1、嵌合抗體方法： 從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人-鼠嵌合抗體特點(diǎn)： 減少了鼠源性抗體的免疫

31、原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力 822021/10/23 星期六832021/10/23 星期六基本原理 從雜交瘤細(xì)胞/淋巴細(xì)胞基因組中分離和鑒別出功能性的VL和VH基因，分別與人的輕、重鏈恒定區(qū)基因相連接，插入適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成人鼠嵌合的重鏈和輕鏈基因，然后共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合抗體。 842021/10/23 星期六852021/10/23 星期六優(yōu)點(diǎn)（1）用人源Fc段替代鼠源Fc 段，可在一定程度上減少體內(nèi)治療時(shí)所誘導(dǎo)的抗異種球蛋白反應(yīng)。（2）因?yàn)榭贵w重鏈C區(qū)所代表的免疫球蛋白同種型（包括類和亞類）的差異可影響抗體的體內(nèi)功能，如產(chǎn)生CDC、ADCC及免疫調(diào)理作用等，所

32、以在構(gòu)建嵌合抗體時(shí)，可有目的地改變抗體的類型或亞類，增加體內(nèi)治療的效果。862021/10/23 星期六2、改型抗體定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具,有鼠源性單抗的特異性又獲得人抗體親和力的移植抗體（CDR-grafted antibody），也稱為改形抗體或重構(gòu)型抗體（reshaping antibody）。 意義：多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療872021/10/23 星期六882021/10/23 星期六構(gòu)建改形抗體的一般性原則1. VH和VL的序列均應(yīng)盡可能選自人的同一種Ig，以減少兩條鏈裝配的不親和性

33、。2. 在選用人的Ig序列時(shí)，應(yīng)選用其可變區(qū)氨基酸序列與鼠源McAb可變區(qū)氨基酸序列同源性最大的Ig，以盡量減少M(fèi)cAb的CDR插入人的FR時(shí)影響CDR的構(gòu)象。3. 用計(jì)算機(jī)構(gòu)建鼠源McAb的分子模型，可以發(fā)現(xiàn)FR中有一些氨基酸殘基與CDR靠得很近，有可能影響CDR構(gòu)象。還有一些FR的氨基酸殘基直接與抗原接觸。如果這氨基酸殘基在人、鼠間不同，則一致改為鼠的殘基。892021/10/23 星期六4. 所選用的人Ig可變區(qū)中含有一些不常用的氨基酸殘基，在改形抗體中則改為Ig通用的殘基。 5. 有些FR序列在進(jìn)化上具有高度保守性，人、鼠Ig之間輕鏈FR2、FR3、和FR4，重鏈的FR1、FR3、和F

34、R4都有完全相同的序列。輕鏈FR1中有一種序列只有一個(gè)殘基不同，重鏈FR3中有一種序列只有兩個(gè)殘基不一致。利用這些序列不僅可能使抗原性降到最低限度，而且可能保持原抗體的親和性。6. 為提高抗體的親和性，可以把CDR中與抗原表面最靠近的帶靜電的殘基換成不帶電的親水殘基，從而使抗體與抗原之間更緊密地結(jié)合。 902021/10/23 星期六3、小分子抗體Fab單鏈抗體單域抗體最小結(jié)合單位912021/10/23 星期六（1）Fab 由重鏈VH加CH1及完整的輕鏈構(gòu)成，大小為完整抗體的1/3。922021/10/23 星期六木瓜蛋白酶水解932021/10/23 星期六942021/10/23 星期六

35、（2）單鏈抗體(scFv)抗體可變區(qū)的重鏈和輕鏈（VH和VL）通過連接肽（約15-25個(gè)氨基酸）連接而成的重組蛋白，即VH-Linker-VL。它是抗體與抗原結(jié)合的最小單位，其分子大小僅為完整抗體的1/6。 952021/10/23 星期六完整抗體scFv962021/10/23 星期六特點(diǎn)具有與原親本抗體相同的特異性；分子量小，可迅速滲透至腫瘤內(nèi)部或其他靶組織；避免了Fc段引起的非特異性細(xì)胞毒性及免疫原性；制備流程簡單。972021/10/23 星期六982021/10/23 星期六小分子抗體的主要應(yīng)用領(lǐng)域靶向載體構(gòu)建其它工程抗體細(xì)胞內(nèi)抗體(intrabody)：將小分子抗體基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，

36、使其在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá)，通過與靶抗原的結(jié)合影響其生物學(xué)活性。992021/10/23 星期六4、雙特異抗體 它有兩個(gè)抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原表位，其中一個(gè)臂可與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合，另一個(gè)臂則可與效應(yīng)物（如藥物、效應(yīng)細(xì)胞等）結(jié)合，從而將效應(yīng)物直接導(dǎo)向靶組織細(xì)胞。 1002021/10/23 星期六化學(xué)交聯(lián)BsAb 分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。 此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。1012021/10/23 星期六細(xì)胞工程BsAb 將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行

37、再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。BsAb在其中的比例可為10%50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng) (HAMA)，因此不適用于臨床。1022021/10/23 星期六基因工程BsAb 多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或 ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達(dá)分泌型的BsAb。1032021/10/23 星期六微型雙特異性抗體diabody 它是將同一抗體的VH和VL區(qū)分布在不同的肽鏈上，構(gòu)成兩種交聯(lián)的ScFv，即 VLA-Linke

38、r-VHB和VLB-Linker-VHA。每條獨(dú)立的ScFv鏈均不具備結(jié)合抗原的活性，而它們從大腸桿菌共分泌后形成的異二聚體，則可同時(shí)識別并結(jié)合兩種特異性抗原。由于它具有這種雙特異性，因此在應(yīng)用上有更大的優(yōu)越性。1042021/10/23 星期六5、抗體融合蛋白 一類是將Fv段與其他生物活性蛋白如毒素、酶等結(jié)合，利用抗體的特異性識別功能將某些生物活性物質(zhì)引導(dǎo)到特定部位。 另一類是含F(xiàn)c段的抗體融合蛋白，它是利用Fc段所特有的生物學(xué)功能與某些有黏附或結(jié)合功能的蛋白融合而成。 1052021/10/23 星期六6、噬菌體抗體 利用基因工程的方法將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來，通過噬菌體表面

39、呈現(xiàn)技術(shù)，將抗體分子Fab段或scFv段表達(dá)在噬菌體膜表面，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體，即噬菌體抗體。這種技術(shù)稱為噬菌體抗體庫(phage antibody library)技術(shù)。所構(gòu)建的抗體庫稱為全套抗體庫(repertoire antibody)或組合抗體庫(combinatorial antibody library)。1062021/10/23 星期六 基本原理 該技術(shù)以噬菌體為載體，將抗體基因(Fab或scFv基因等)與噬菌體編碼的外殼蛋白(CP)或（CP）相連，在噬菌體表面以抗體外殼蛋白融合蛋白的形式表達(dá)，經(jīng)輔助病毒感染后，借助CP的信號肽穿膜作用，進(jìn)入宿主外周基質(zhì)，在正確折疊后被包裝

40、于噬菌體尾部，隨著攜帶有表達(dá)載體的宿主菌就會(huì)釋放出帶有抗體的噬菌體。這種噬菌體抗體可以特異識別抗原，又能感染宿主進(jìn)行再擴(kuò)增。因此可以采用類似于親和層析原理從噬菌體抗體庫中篩選出特異性抗體。1072021/10/23 星期六構(gòu)建噬菌體抗體庫從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細(xì)胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的Ig基因片段；構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫(surface display antibody library)常用載體；表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全

41、套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。1082021/10/23 星期六基本原理 :1092021/10/23 星期六主要特點(diǎn)：基因型和表型相統(tǒng)一選擇能力和再擴(kuò)增能力相結(jié)合融合蛋白PIII基因型表達(dá)型1102021/10/23 星期六1112021/10/23 星期六優(yōu)點(diǎn)1.模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達(dá)到或超過1011庫容,能包含B細(xì)胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細(xì)胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性方法簡單易行，節(jié)省時(shí)間?？赏ㄟ^發(fā)酵生產(chǎn)、大量制備。2.避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)抗體庫的大容量抗體庫極高的篩選效率3. 可獲得高親和力的人源化抗體VH和VL基因的隨機(jī)重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程所用的抗體基因又來自人體1122021/10/23 星期六 四、抗體的應(yīng)用1132021/10/23