工學(xué)第3章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)課件

1、生物制藥基礎(chǔ)化學(xué)化工學(xué)院陶洪文1第三章 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥技術(shù)2第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥技術(shù)概述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和制備細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法和操作方式動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用3一. 概 述 20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)外突形成，還是由神經(jīng)細(xì)胞周?chē)钠渌?xì)胞融合而成。 1907年，美國(guó)生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長(zhǎng)出了神經(jīng)纖維。 哈里森的實(shí)驗(yàn)解決了神經(jīng)纖維的起源問(wèn)題，開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。此后，動(dòng)物組織培養(yǎng)不斷改進(jìn)并逐漸

2、發(fā)展成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的起源4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 就是從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖.用培養(yǎng)的人細(xì)胞構(gòu)建人造皮膚5動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞部分細(xì)胞“癌變”，無(wú)限傳代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成動(dòng)物體50代細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁剝離、分瓶細(xì)胞株細(xì)胞細(xì)胞系2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程：接觸抑制遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)改變6動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝流程7有關(guān)概念:原代培養(yǎng)： 從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代

3、細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。8細(xì)胞株：原代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到4050代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。 細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無(wú)限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。 細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。9細(xì)胞貼壁：細(xì)胞懸液中的分散細(xì)胞貼附到培養(yǎng)瓶壁上。 要求培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無(wú)毒、易于貼附。 接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞會(huì)停

4、止運(yùn)動(dòng)，但不影響細(xì)胞分裂增殖。 密度抑制：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)平板，達(dá)到一定密度后，細(xì)胞會(huì)停止分裂增殖。10動(dòng)物細(xì)胞鏡檢形態(tài)高密度低密度懸浮型細(xì)胞11整體放大貼壁型細(xì)胞12二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)特性1.分裂期長(zhǎng)12-48小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染。2.細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境影響大 動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感,滲透壓、酸度、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化都會(huì)影響其生長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求很高，需要 12種必需氨基酸、8種以上維生素、多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素、葡萄糖外，還需要多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和貼壁因子.133. 培養(yǎng)需氧少，不耐強(qiáng)力通風(fēng)和攪拌正常二倍體細(xì)胞的壽命是有限的，一般繁殖50代左右

5、，就逐漸死亡。4. 培養(yǎng)時(shí)有群體效應(yīng)、錨地依賴性、接觸抑制性和功能全能性5. 產(chǎn)物在胞外，成本高，但價(jià)格昂貴6. 與微生物有區(qū)別，培養(yǎng)時(shí)不可套用經(jīng)驗(yàn)7. 原代培養(yǎng)一般50代及退化死亡14三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成與制備1)所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對(duì)無(wú)菌，避免污染； 2)必須有足夠的營(yíng)養(yǎng)保證，絕對(duì)不可有有害的物質(zhì)，避免有害離子；3)保證有適量的氧氣供應(yīng)； 4)需隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中的有害產(chǎn)物； 5)有適于生存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度； 6)及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度。 1.動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)所需條件 152.動(dòng)物培養(yǎng)基的種類和組成 1）天然培養(yǎng)基：血漿凝塊、血清、淋

6、巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。 2）合成培養(yǎng)基：組成穩(wěn)定可大量生產(chǎn)供應(yīng)。成分為氨基酸（細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料）、維生素（維持細(xì)胞生命活動(dòng)的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔基或輔酶）、糖類（碳源）、無(wú)機(jī)鹽（保持細(xì)胞的滲透壓并參與代謝）、緩沖系統(tǒng)、礦物類、有機(jī)補(bǔ)充物、激素類、生長(zhǎng)因子類。合成培養(yǎng)基中除了各種營(yíng)養(yǎng)成分外，還需添加 5%-10%的小牛血清，才能使細(xì)胞很好地增殖.16添加小牛血清的作用：1、提供有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖所需的各種生長(zhǎng)因子和激素；2、提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子；3、提供可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；4、提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的脂肪酸和微量元素。 17 3、無(wú)血清培養(yǎng)

7、基 無(wú)血清培養(yǎng)基在天然或合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素。優(yōu)點(diǎn)：增加確定性；性能更一致；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；容易進(jìn)行純化和下游加工提高制品安全性和產(chǎn)量。18培養(yǎng)基的性質(zhì)1.pH：哺乳類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)需要合適的酸堿度，多為7.27.4,不超過(guò)6.87.6范圍，同時(shí)pH值的測(cè)定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異 2.滲透壓：細(xì)胞必須生活在合適的滲透壓環(huán)境中（690850kPa）；同時(shí)滲透壓值的測(cè)定也可以檢查培養(yǎng)基的批間差異3.溫度：哺乳動(dòng)物多為36.5 0.5 4.黏度：CMC和聚乙烯吡咯烷酮5.表面張力和泡沫19四、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的檢測(cè) （一）細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè) 細(xì)胞計(jì)數(shù)（血

8、小板計(jì)數(shù)器） 細(xì)胞常規(guī)檢查（污染與否、pH） 生長(zhǎng)情況、細(xì)胞形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)液、污染和細(xì)胞活性（死細(xì)胞著色 計(jì)數(shù)） 生物學(xué)檢查和鑒定 支原體污染檢查 20 細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程 每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程：游離期、貼壁期、潛伏期、對(duì)數(shù)生和長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）。（1）游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘-4小時(shí)。（2）貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘-4小時(shí)貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等. 血清中有促使細(xì)胞貼壁的和纖粘素、膠原等糖蛋白，這些糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。21（3）

9、潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。（4）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期： 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。（5）停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。22培養(yǎng)物污染的預(yù)防細(xì)菌、真菌、病毒或細(xì)胞均可導(dǎo)致培養(yǎng)物污染。生物的組織材料、操作者自身、培養(yǎng)基、各種器皿、甚至環(huán)境均可引起污染。顯著污染的標(biāo)志是培養(yǎng)基PH值迅速改變、外形模糊、甚至出觀漂浮的集落。常用抗生素：青霉素（200單位/mL）；卡那霉素（200ug/mL）。支原體污染的控制：抗生素處理；支原體血清處理；高熱處理23防止交叉污染。從事體外細(xì)胞培養(yǎng)的工作者都必須遵循這樣一個(gè)原則：

10、在任何時(shí)間，在一個(gè)工作區(qū)中決不能有一種以上的細(xì)胞系的細(xì)胞同時(shí)存在。一種細(xì)胞系的細(xì)胞所用的培養(yǎng)基、器皿、移液管等決不能為另一種細(xì)胞系的細(xì)胞所移用。一旦在同質(zhì)的細(xì)胞群中出現(xiàn)不同形態(tài)的集落，則應(yīng)懷疑是否發(fā)生了細(xì)胞污染，且用染色體組型及同功酶組型鑒定。24（二）細(xì)胞培養(yǎng)工藝控制1.溫度控制：采用鉛電阻溫度計(jì)控制2.pH與溶解氧控制：碳酸氫鹽緩沖溶液，另外可以通過(guò)通CO2,O2控制。3.葡萄糖和乳酸檢測(cè)4.產(chǎn)物的收集和檢測(cè)25五、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法和操作方式根據(jù)不同的需要將離體培養(yǎng)的細(xì)胞分為三類：1、貼壁細(xì)胞 生長(zhǎng)時(shí)必須要有給以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)

11、和繁殖，在培養(yǎng)過(guò)程中，隨著培養(yǎng)條件的變化細(xì)胞形態(tài)也會(huì)發(fā)生改變。 262、懸浮細(xì)胞 生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，如淋巴細(xì)胞等。 3、兼性貼壁細(xì)胞 根據(jù)生長(zhǎng)條件的不同可貼壁也可懸浮生長(zhǎng)，中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞。 271.細(xì)胞培養(yǎng)方法1)懸浮培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。缺點(diǎn)：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌和氣升式2)貼壁培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達(dá)到高密度細(xì)胞。缺點(diǎn)：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。 283)固定化培養(yǎng)（1）吸附培養(yǎng) 細(xì)胞貼附于

12、支持物表面 （2）共價(jià)貼附 化學(xué)鍵結(jié)合（3）離子/共價(jià)交聯(lián)（4）包埋和微囊培養(yǎng)，包埋或包裹在凝膠載體和微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細(xì)胞密度；通過(guò)控制微囊膜的孔徑可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)有利于下游處理；可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng) 292.細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1）分批式培養(yǎng)操作2）流加式培養(yǎng)操作3）半連續(xù)式培養(yǎng)操作4）連續(xù)式培養(yǎng)操作5）灌注式培養(yǎng)操作30六、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1.用于生物制品的生產(chǎn)：如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體2.基因工程中受體細(xì)胞的培養(yǎng)：選用合適宿主、改變細(xì)胞的某些酶基因、改進(jìn)控制培養(yǎng)條件使產(chǎn)物正確糖基化。3.組織工程研究:通過(guò)對(duì)細(xì)胞大量培養(yǎng)，并

13、用細(xì)胞直接作為一種治療手段用于臨床，或用細(xì)胞進(jìn)一步加工構(gòu)成一種組織，如皮膚、肝臟、胰腺等用于臨床治療。31第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥技術(shù) 植物細(xì)胞培養(yǎng)：指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的的組織置于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過(guò)傳代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)。一、概述32植物細(xì)胞培養(yǎng)流程 33二 、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性與營(yíng)養(yǎng) （一）植物細(xì)胞的特性 1.植物細(xì)胞的組成 植物細(xì)胞由細(xì)胞壁和原生質(zhì)體組成，原生質(zhì)體包括 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和液泡。 2.細(xì)胞后含物和生理活性物質(zhì) 細(xì)胞中除含有生命物質(zhì)原生質(zhì)體外，還有許多非生命物質(zhì)，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，一類是后含物

14、，儲(chǔ)藏物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，生物堿、糖類、苷、鹽類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等，另一類是生理活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生化代謝和生理活動(dòng)起著調(diào)節(jié)作用。 34 3.細(xì)胞的全能性: 即單一的離體細(xì)胞在一定的環(huán)境條件下能分化成不同細(xì)胞組織乃至整個(gè)植株的能力。 4.細(xì)胞分化：是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。細(xì)胞分化也可以說(shuō)是相同基因型的細(xì)胞所具有的各個(gè)不同的表現(xiàn)型。 它包括：時(shí)間上的分化：一個(gè)細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能；空間上的分化：對(duì)于多細(xì)胞生物來(lái)講，同一細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。 5.脫分化：植株上已經(jīng)分化的細(xì)胞或組織離體后在培養(yǎng)條

15、件下逐漸恢復(fù)到分生狀態(tài)的過(guò)程。細(xì)胞脫分化的結(jié)果通常是形成愈傷組織（未分化的細(xì)胞團(tuán)）。35植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性 植物細(xì)胞重量的增加主要在對(duì)數(shù)期，次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積主要在穩(wěn)定期。與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類同，生長(zhǎng)速率慢，為防止培養(yǎng)過(guò)程中染菌，需加抗生素；細(xì)胞大，細(xì)胞壁以纖維素為主要成分，表現(xiàn)為抗張力強(qiáng)度大，抗剪切力能力小。植物細(xì)胞常生長(zhǎng)成各種大小的團(tuán)塊，增加了懸浮培養(yǎng)的難度等。細(xì)胞培養(yǎng)需氧，但培養(yǎng)時(shí)不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制氧量，以保持較低的溶氧水平泡沫性質(zhì)不同于發(fā)酵，氣泡大，黏度也大，通常要采用化學(xué)或機(jī)械方法加以控制。產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)且產(chǎn)量低。36（二）植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分及其培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的成分由無(wú)機(jī)

16、鹽類、碳源、維生素、植物生長(zhǎng)激素、有機(jī)氮源、有機(jī)酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。1. 無(wú)機(jī)鹽 有大量元素和微量元素，30 毫克每升為界限，大量有氮、硫、磷、鉀、鎂、鈣、氯、鈉。微量有鐵、錳、碘、鉬、銅、鋅。2、有機(jī)質(zhì) 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（提供C、H、O和N） 生理活性物質(zhì)373、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 植物激素是植物代謝過(guò)程中形成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（小于 1 微摩爾）時(shí)即能調(diào)節(jié)植物的生育過(guò)程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮作用。常見(jiàn)的植物激素有生長(zhǎng)素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯。植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)過(guò)程主要取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例，比值高可刺激細(xì)胞分裂，比值低則刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。384.附加物：瓊脂

17、、蔗糖、活性碳等，非必須，但對(duì)生長(zhǎng)有利。5.成分未知的天然汁液,提供必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素物質(zhì)。39選擇培養(yǎng)基的原則：需要根據(jù)不同培養(yǎng)對(duì)象、培養(yǎng)目的及培養(yǎng)條件探索適宜培養(yǎng)基。 選擇的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程使細(xì)胞總體積倍增時(shí)間1天左右為宜。 培養(yǎng)基的配制過(guò)程：母液配制、混合、稀釋、pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌。40（三）植物細(xì)胞的培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟（1）植物材料的準(zhǔn)備和清洗、消毒等 用于植物組織培養(yǎng)的外植體必須無(wú)菌。 常用表面滅菌試劑的特點(diǎn)是滅菌后易于除去或容易分解的試劑，根據(jù)所處理材料對(duì)滅菌試劑的敏感性選擇適當(dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間。常用滅菌試劑有次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞。 次氯酸

18、鈣為工業(yè)漂白粉過(guò)濾后的飽和溶液，適用于草本植物和柔軟組織的滅菌處理，時(shí)間為5-30分。 氯化汞滅菌效果好，但不易除去，時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，以免殺死植物細(xì)胞，當(dāng)其用于休眠種子的滅菌劑最為理想，適用濃度為 0.1%，2-10 分鐘，種子皮較厚時(shí)可延長(zhǎng)至 20分以上。 41（2）準(zhǔn)備培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是指人工配制的含有營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)供培養(yǎng)物生長(zhǎng)分化的介質(zhì)。通常含無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及有機(jī)附加物(維生素、甘氨酸)等幾類物質(zhì)組成。（3）接種 在無(wú)菌條件下操作，把材料放進(jìn)培養(yǎng)基42（4）愈傷組織的培養(yǎng)和誘導(dǎo)愈傷組織：原指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在 傷口表面新生的組

19、織。它由活的薄壁細(xì)胞組成。在離體培養(yǎng)條件下，外植體中的活細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)脫分化，恢復(fù)其潛在的全能性，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，繼而其衍生的細(xì)胞分化為薄壁組織而形成愈傷組織 愈傷組織類型：結(jié)構(gòu)致密型：表面光滑有光澤，結(jié)構(gòu)致密，多為淡黃色或白色，易于再生芽 結(jié)構(gòu)松散型：多為白色，可以用于懸浮系建立43（5）誘導(dǎo)產(chǎn)生器官或體細(xì)胞胚 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組織營(yíng)養(yǎng)成分組成，愈傷組織在傳代培養(yǎng)若干代后，產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)(器官原基),該細(xì)胞群能適應(yīng)進(jìn)一步的的懸浮培養(yǎng)，形成器官（先芽后根），從而建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞系（6）移栽4445三.植物細(xì)胞培養(yǎng)的類型與技術(shù) 根據(jù)所處狀態(tài)的不同，分為懸浮培養(yǎng)與固定化植物細(xì)胞培養(yǎng)法。 懸浮培養(yǎng)法

20、 分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法 固定化培養(yǎng)法 包埋技術(shù)吸附技術(shù)共價(jià)結(jié)合技術(shù)461.分批培養(yǎng)法 與微生物的分批培養(yǎng)類同。由于操作簡(jiǎn)單，從實(shí)驗(yàn)室到大型罐廣泛應(yīng)用。分批培養(yǎng)中，植物細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線一般呈S型，可明顯觀察出誘導(dǎo)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期。但是與細(xì)菌和酵母菌的培養(yǎng)相比，即使是生長(zhǎng)速率快的煙草細(xì)胞，分批培養(yǎng)時(shí)間（一個(gè)周期）也要6天以上，生長(zhǎng)緩慢。主要采用氣升式反應(yīng)器，其培養(yǎng)過(guò)程用通氣代替攪拌，細(xì)胞產(chǎn)量高。47 生物種類 (h-1) 平均世代時(shí)間 (h) 煙草 0.0320.044 421.717.3 番茄 0.0140.026 49.526.7 胡蘿卜 0.021 33.0

21、釀酒酵母 0.50.65 1.391.07 紅曲霉 0.125 5.54 植物與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)速率的比較48 目前，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)室還是在工廠中，大至20噸罐，廣泛采用分批式操作。 藤田開(kāi)發(fā)的二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法的一種變形，同時(shí)使用兩個(gè)反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器主要是為大量培養(yǎng)細(xì)胞，即使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基使細(xì)胞大量增殖，達(dá)到了一定的細(xì)胞密度。第二個(gè)反應(yīng)器是為增加目的產(chǎn)物的含量。改用適合細(xì)胞產(chǎn)物積累的培養(yǎng)基，促進(jìn)細(xì)胞啟動(dòng)，次級(jí)代謝途徑并提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。 分批培養(yǎng)中，在一定范圍內(nèi)增加底物濃度，可增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，但濃度過(guò)高又會(huì)造成接種細(xì)胞的死亡。492.半連續(xù)培養(yǎng)法 在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分

22、培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法稱之為半連續(xù)培養(yǎng)法。反應(yīng)過(guò)程通常以一定時(shí)間間隔進(jìn)行數(shù)次反復(fù)操作以達(dá)到培養(yǎng)細(xì)胞與生產(chǎn)有用物質(zhì)的目的。 503.連續(xù)培養(yǎng)法 采用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，以一定速度連續(xù)采集細(xì)胞與培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境長(zhǎng)期維持恒定。連續(xù)培養(yǎng)法細(xì)胞生產(chǎn)能力一般較分批法高，但因細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，要維持系統(tǒng)無(wú)菌狀態(tài)，技術(shù)條件要求相當(dāng)苛刻。514.固定化培養(yǎng)法 固定化培養(yǎng)采用固定化反應(yīng)器，這類反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套及中空纖維膜等形式。將細(xì)胞固定在尼龍網(wǎng)套內(nèi)或固定于中空纖維膜反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放在

23、培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，可通入凈化空氣代替攪拌。固定化培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體及建立細(xì)胞間物理學(xué)和化學(xué)聯(lián)系，維持細(xì)胞間物理化學(xué)梯度，易于控制培養(yǎng)條件及獲得次生產(chǎn)物。 52常用固化劑有瓊脂、明膠、藻酸鹽、羥乙基纖維素。 培養(yǎng)溫度為 25左右，常需光照。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)要不斷消耗養(yǎng)分、散失水分和累積代謝產(chǎn)物，因此外植體在培養(yǎng)周左右必須移至新鮮培養(yǎng)基上，以保持繼續(xù)生長(zhǎng)。移換一次培養(yǎng)基成為一次繼代培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物可用于懸浮培養(yǎng)。53優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行、所占空間小缺點(diǎn)：是外植體或愈傷組織僅有一部分與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)基中產(chǎn)生濃度差，愈傷組織生長(zhǎng)不平衡；外

24、植體基部插入培養(yǎng)基中，該處氣體交換不暢阻礙了組織呼吸正常進(jìn)行，會(huì)堆積生長(zhǎng)過(guò)程中的有害物質(zhì)；在愈傷組織細(xì)胞間出現(xiàn)極化現(xiàn)象，細(xì)胞群體不均一。54四、影響植物次級(jí)代謝物累積的因素1、組織來(lái)源：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；2、化學(xué)培養(yǎng)條件：無(wú)機(jī)鹽、碳源、物質(zhì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；3、物理?xiàng)l件：溫度、光（光照時(shí)間、光強(qiáng)、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、pH和滲透壓551.組織來(lái)源外植體直接影響所誘導(dǎo)的組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且也關(guān)系到其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。外植體的前處理也可嚴(yán)重影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積方式。一定培養(yǎng)條件下不同植物細(xì)胞及同一植株不同部位細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同，次生物產(chǎn)率

25、也不同，應(yīng)選擇生長(zhǎng)速度快及次生物產(chǎn)率高的細(xì)胞為培養(yǎng)材料。562.化學(xué)培養(yǎng)條件1）培養(yǎng)基的組成，基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。碳源：自養(yǎng)培養(yǎng)的二氧化碳和異養(yǎng)培養(yǎng)的糖類，性質(zhì)和數(shù)量往往對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生物量有很大的影響。糖的作用有：延長(zhǎng)穩(wěn)定期；通過(guò)蔗糖分解后的產(chǎn)物（葡萄糖）所產(chǎn)生的對(duì)內(nèi)源性生長(zhǎng)素合成的抑制作用；增強(qiáng)戊糖磷酸化途徑有關(guān)酶的活性磷：低磷會(huì)導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷會(huì)導(dǎo)致生物量的大幅度降低。57氮：硝酸鹽、銨鹽、有機(jī)氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨銅：作為鄰及對(duì)-二酚可抗壞血酸氧化酶活性基團(tuán)的作用，是次級(jí)代謝產(chǎn)物累積的必要元素，還可作為非生物誘導(dǎo)子。

26、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：其種類和數(shù)量對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有很大影響。(2) 誘導(dǎo)子: 植物抗毒素是在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對(duì)抗微生物進(jìn)攻的某些次級(jí)代謝產(chǎn)物，有些時(shí)候連續(xù)合成，或僅在被誘導(dǎo)下其產(chǎn)量才能增加。觸發(fā)形成植物抗毒素信號(hào)的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)子，能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中的一個(gè)反應(yīng)，并能形成特征性自身防御反應(yīng)的分子。583.物理培養(yǎng)條件的影響（1）溫度：溫度對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)有一定影響。如煙草NC2512細(xì)胞分別于20，25及30培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)20及25時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度均良好，但25時(shí)尼古丁產(chǎn)率更高；甘薯懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物從30和32向25轉(zhuǎn)移后，對(duì)培養(yǎng)基中蔗糖及氨利用率下降，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。次級(jí)代謝產(chǎn)物的

27、最佳產(chǎn)生溫度是 20-28 ，低溫時(shí)細(xì)胞不再生長(zhǎng)，產(chǎn)物不合成。59(2)光的影響：光照時(shí)間的長(zhǎng)短、光質(zhì)、光強(qiáng)對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積有不同影響。如在連續(xù)紅光或遠(yuǎn)紅光作用下，玫瑰細(xì)胞培養(yǎng)物形成的揮發(fā)油成分與連續(xù)黑暗培養(yǎng)者相似；而用藍(lán)光或白色熒光照射15h或24h所形成的成分相似，但不同于暗培養(yǎng)者。有時(shí)光照對(duì)某些次生物質(zhì)的合成亦有抑制作用，如煙草NC2512細(xì)胞培養(yǎng)物連續(xù)暗處理，其尼古丁含量高于連續(xù)光照處理；有些植物細(xì)胞次生物產(chǎn)率不受光照影響，如橙葉雞血藤細(xì)胞培養(yǎng)物的蒽醌產(chǎn)率不受光照影響。植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，光照影響是復(fù)雜的，故需根據(jù)不同培養(yǎng)對(duì)象，采取不同光處理措施。60（3）通氣 細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程需維持其

28、正常呼吸作用，懸浮細(xì)胞及固定化細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)供氧方式有不同，前者可采用攪拌和通氣方式，后者僅能采用通氣方式，攪拌轉(zhuǎn)速通常為rmin，過(guò)快則易破壞細(xì)胞；通氣過(guò)程，一般用含的潔凈空氣為佳，通氣量適當(dāng)，供氧量過(guò)多或過(guò)少均影響細(xì)胞生長(zhǎng)及次生物產(chǎn)量。 （4）酸度： 一般植物細(xì)胞培養(yǎng)基pH5一6為宜，如甘薯細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，維持其pH為6.3，次生物產(chǎn)量較不控制pH高一倍，當(dāng)pH降至4.時(shí)，其色氨酸積累完全抑制。61（5）培養(yǎng)容器的影響：因?yàn)槿萜鞯拇笮『蛿嚢柩b置的不同會(huì)產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。攪拌速度也有影響，表現(xiàn)在發(fā)酵液中的溶氧濃度和機(jī)械攪拌對(duì)細(xì)胞所產(chǎn)生的剪切力上。 62（五）植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1 利用植物細(xì)胞培

29、養(yǎng)進(jìn)行藥物生產(chǎn) 太平洋紫杉細(xì)胞生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇、人參細(xì)胞培養(yǎng)人參皂苷和人參多糖、毛地黃細(xì)養(yǎng)轉(zhuǎn)化毛地黃毒苷典型案例：紫杉醇生產(chǎn)63 紫杉醇(Paclitaxel)是繼阿霉素和鉑類抗癌藥之后本世紀(jì)后期最受人們重視的一種抗癌新藥，是一新發(fā)現(xiàn)的有絲分裂抑制劑，其作用機(jī)理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細(xì)胞的復(fù)制受到阻斷而凋亡。 1967年美國(guó)化學(xué)家Wall和Wani等首先從太平洋紫 杉（短葉紅豆杉，Taxus. brevifolia）樹(shù)皮中提取出來(lái)。該藥于1990年進(jìn)入期臨床試驗(yàn)， 1992年底獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。 64 紫杉醇存在于紅豆杉屬植物的樹(shù)皮、葉及莖中， 其中樹(shù)皮中的含量最高，大約從12000株成年紫杉樹(shù)中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生長(zhǎng)周期很長(zhǎng)，在世界分布很少。 紫杉醇的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格為450美元/g 65 日本有關(guān)組織從紅豆杉中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，篩選得到細(xì)胞培養(yǎng)4周就增殖了5倍，紫杉醇