抗原與抗體反應(yīng)免疫檢測實驗原理和方法精選課件

1、第三節(jié) 抗原與抗體反應(yīng)-免疫檢測法 抗原與抗體結(jié)合后，只有出現(xiàn)可見的反應(yīng)，如凝集、溶血、沉淀實驗等，或用熒光素、酶、放射性同位素等標(biāo)記方法提高可測性，才便于在免疫檢測中運用?？梢娦苑磻?yīng)的出現(xiàn)，對抗原抗體分子合適比例的要求遠(yuǎn)比對彼此絕對量方面要高得多。這就是說，一方面在進(jìn)行免疫檢測時要注意抗原抗體的用量；另一方面只要提高可見度或可測性，便可大大提高免疫檢測方法的靈敏度。一、凝集反應(yīng) 凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆粒抗原如完整的細(xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。二、沉淀反應(yīng) 當(dāng)抗原是可溶性分子時，與抗體結(jié)合則

2、形成沉淀。1、絮狀沉淀反應(yīng) 一系列試管中加入等量的抗體和遞增量的抗原，在中性條件下37度保溫1-2h，便可見到絮狀的蛋白質(zhì)沉淀。可用于尋找抗原抗體反應(yīng)的合適比例，檢測抗原抗體的分子比。2、環(huán)狀沉淀反應(yīng) 在試管中加入抗體后，小心加入相應(yīng)抗原，使抗原抗體步混合，37度保溫10-20min，在二者界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀。不能用于定量測定。3、雙向擴散：又稱瓊脂擴散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。 瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時形成沉淀?？捎^測到沉淀弧。 沉淀弧的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體存在多種

3、體系時，會出現(xiàn)多條沉淀弧。雙向擴散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。 抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。4、單向免疫擴散：又稱單向瓊脂擴散，是定量抗原的一種檢測方法。與雙向擴散不同的是在瓊脂中含有一定量的抗體，孔內(nèi)加入未知量的相應(yīng)抗原。在37度保溫過程中，孔內(nèi)的抗原向周圍擴散，與抗體形成沉淀圈。根據(jù)沉淀圈的大小確定抗原的含量 另外還有其他眾多的免疫檢測技術(shù)和手段

4、，其機理都利用了抗原抗體的沉淀反應(yīng)。例如微量免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。只不過其檢測的對象和檢測的目的各有不同。三、補體結(jié)合試驗 當(dāng)抗體與細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆?？乖Y(jié)合并形成抗原抗體復(fù)合物后，可結(jié)合補體引起溶菌、溶血效應(yīng)。用補體結(jié)合試驗既可以測知患者血清中補體的總量，也可以檢測未知抗原或抗體的量。 測定人血清補體總量的方法是以綿羊紅血球的溶血為指示。當(dāng)綿羊紅血球與抗綿羊紅血球結(jié)合后，加患者血清，觀測溶血程度。 用于測定未知抗原/抗體時，采用兩套系統(tǒng)，一套是待測的抗原抗體系統(tǒng)，稱為檢測系統(tǒng)，一套是包括綿羊紅血球和抗綿羊紅血球抗體的指示系統(tǒng)。待測系統(tǒng)中有無待測得抗原/抗體是利用指示系統(tǒng)中是否出

5、現(xiàn)溶血來判斷。 反應(yīng)的過程是首先加待測得抗原/抗體，反應(yīng)一段時間后加入補體，在反應(yīng)一段時間后加指示系統(tǒng)。有待測抗原抗體結(jié)合時，必然結(jié)合補體，不會出現(xiàn)溶血，沒有待測物質(zhì)時出現(xiàn)溶血。四、熒光抗體技術(shù) 免疫熒光法是將熒光素與特異性血清抗體以化學(xué)方式結(jié)合起來，然后將此熒光標(biāo)記了的抗體作為一種試劑在特定條件下浸染標(biāo)本，使與標(biāo)本中相應(yīng)的抗原產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，再在熒光顯微鏡下，以紫外光為光源進(jìn)行觀察。當(dāng)出現(xiàn)熒光時，表明標(biāo)記抗體存在，相應(yīng)的抗原也存在。 免疫熒光法有直接法和間接法兩種。第四節(jié) 免疫親和層析 生物高分子具有能和某種相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，例如酶的活性中心或別構(gòu)中心能和專一的底物、抑制劑、輔助因子效應(yīng)劑通過某些次級鍵相結(jié)合，并在一定條件下又可以解離?？贵w與抗原，激素及其受體，核糖核酸與其互補的脫氧核糖核酸等體系，都具有類似的特性。這種高分子和配基之間形成專一的可解離的復(fù)合物的能力稱為親和力。根據(jù)這種具有親和力的生物分子間可逆的結(jié)合和解離的原理發(fā)展起來的層析就稱為親和層析。親和層析法的基本過程：1、偶聯(lián)：將欲分離的高分子物質(zhì)的配基在不影響其生物功能的情況下與水不相溶性的載體結(jié)合，制成親和吸附劑或免疫吸附劑。2、裝柱：在層析柱內(nèi)裝入固相化的配基3、親和層析：含有高分子物質(zhì)的混合液在有利于配基和高分子之間形成復(fù)合物的條件下進(jìn)入裝