蛋白質(zhì)的通性、純化以及表征

1、第三章蛋白質(zhì)的通性、純化以及表征一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則四、蛋白質(zhì)的分離純化方法五、蛋白質(zhì)相對分子量的測定六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定本 章 重 點(diǎn)蛋白質(zhì)分離基于蛋白質(zhì)的哪些性質(zhì)？主要純化方法的原理？大概能夠針對蛋白質(zhì)的性質(zhì)的差異設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離一蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)1. 蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán) 2. 等電點(diǎn)：在某一pH,蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，靜電荷為零，這一pH稱謂蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。蛋白質(zhì)所

2、帶電荷性質(zhì)取決于可解離基團(tuán)的種類和數(shù)目以及溶液的pH。 每種蛋白質(zhì)都有它特有的等電點(diǎn)，這也是鑒別蛋白質(zhì)的指標(biāo)之一。蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸含量與等電點(diǎn)的關(guān)系:等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸的種類和數(shù)目有關(guān)。3. 等離子點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在有中性鹽存在下可以發(fā)生明顯的變化。 Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42- 等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)在沒有其它鹽類干擾的純水中，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的溶液的pH值。等離子點(diǎn)是一個特征常數(shù)。 二 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)溶液中，蛋白質(zhì)分子的直徑介于1100nm，該分散系統(tǒng)為膠體溶液系統(tǒng)。布郎運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象

3、、不能透過半透膜）。膠體系統(tǒng)保持穩(wěn)定的三個因素 顆粒大小在1100nm范圍內(nèi)顆粒表面帶有同種凈電荷與水形成水化層（一）膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)分子很大，在水中形成膠體溶液。蛋白質(zhì)主要是指球狀蛋白質(zhì)，它的親水基團(tuán)都在表面，因此與水有很大的親和力，成為親水膠體。 蛋白質(zhì)的親水膠體溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的，一方面由于蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)會吸引它周圍的水分子，使水分子定向排列在它的周圍，形成“水化層”。另一方面由于蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時帶有同種電荷，與周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的“雙電層”，同種電荷相斥，也使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不會聚合。 穩(wěn)定親水膠體的因素： 水化膜 表面電荷 當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋

4、白質(zhì)的構(gòu)象時，蛋白質(zhì)就會從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀。應(yīng)用:(1)蛋白質(zhì)分離純化(2)解毒(3)臨床檢驗(yàn)（二）蛋白質(zhì)的沉淀 +帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化層+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用 蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)膠體溶液沉淀作用示意圖(1) 鹽析法( salting out)向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀稱為鹽析。常用的中性鹽：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性。硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等使蛋白質(zhì)沉淀的方法概念：特點(diǎn)：作用原理:鹽離子與水親和力極強(qiáng)，脫去蛋白水化層而聚集沉淀(2) 有機(jī)溶劑沉淀法使蛋

5、白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)表面電荷減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。 必須在低溫下操作注意事項(xiàng):盡量縮短處理的時間 及時將蛋白質(zhì)中殘存的有機(jī)溶劑除去甲醇、乙醇、丙酮缺點(diǎn)： 原理:常用有機(jī)溶劑:常會使蛋白質(zhì)變性重金屬離子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等帶有正電荷，能與蛋白質(zhì)分子中帶負(fù)電的基團(tuán)結(jié)合，生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀。(3) 重金屬鹽沉淀法此法常使蛋白質(zhì)變性失活。若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI，沉淀更易發(fā)生缺點(diǎn)：原理:生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等)，某些酸類(主要是指三氯醋酸、磺酰水楊酸和硝酸等)，與帶正電的蛋白質(zhì) 結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀。(4) 生物

6、堿試劑和某些酸類沉淀法反應(yīng)溶液的pHpI，確保蛋白質(zhì)以陽離子形式存在 缺點(diǎn)： 原理:常引起蛋白質(zhì)變性注意事項(xiàng):（5）加熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時，加熱凝固最完全，最迅速？蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，破壞了蛋白質(zhì)的水化層破壞電荷情況（一） 純化的總目標(biāo) （二） 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 三 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則（一）目的 蛋白質(zhì)在生物體中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，在實(shí)際工作中，要研究或應(yīng)用某種蛋白質(zhì)，必須將其分離提純到一定的水平。 研究蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、組成和某些物理化學(xué)性質(zhì)，需要純的均一的甚至是晶體的蛋白質(zhì)樣品； 研究活性蛋白質(zhì)的生物功能，不但需

7、要把樣品提純到一定的水平，而且樣品還要保持它的天然構(gòu)象，要盡量避免因變性而失活； 在制藥工業(yè)中，需要把某些具有特殊功能的蛋白質(zhì)提純到規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，特別是要把一些具有干擾或拮抗性質(zhì)的成分除去。1、總目標(biāo) （1）增加制品的純度（purity）或比活性（specific activity）即增加單位蛋白質(zhì)重量中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量或生物活性；（2）并且使目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。（二）一般原則 2、分離提純的一般程序 含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的動植物組織、細(xì)胞或微生物體 前處理 可溶性蛋白質(zhì)混合物抽提液 粗分級分離已除去大量雜質(zhì)的蛋白質(zhì)濃縮液 細(xì)分級分離高純度的蛋白質(zhì)制品第一步：前處理 破碎含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的動植物

8、組織、細(xì)胞培養(yǎng)液或微生物體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液使目標(biāo)蛋白質(zhì)以溶解的方式釋放出來并保持其天然活性，然后采用離心或過濾的方式棄去固體雜質(zhì)，得到蛋白質(zhì)混合物抽提液。 原材料選擇 組織和細(xì)胞破碎(勻漿器，組織搗碎機(jī) 超聲破碎，酶處理） 抽提 離心 將組織和細(xì)胞破碎動物組織和細(xì)胞：電動搗碎機(jī) 勻漿器 超聲波處理植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨 纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）差速離心法收集細(xì)胞的某一組分（differential centrifugation)第二步：粗分級 經(jīng)前處理以后獲得的蛋白質(zhì)混合物提取液一般成分復(fù)雜、目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度較低，因而首先采用一些

9、簡便、處理量大的作用方式，以除去其中的大量雜質(zhì)，同時使蛋白質(zhì)得到濃縮。該步操作一般包括鹽析、等電點(diǎn)沉淀及有機(jī)溶劑分級分離等。 第三步：細(xì)分級 對經(jīng)粗分級分離后，體積已經(jīng)較小，且已除去了大量雜蛋白的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步的處理，以使樣品得到更進(jìn)一步的純化。包括層析（GF，IEC，AC）、電泳、結(jié)晶等技術(shù)。 電泳 前處理粗分離細(xì)分離生物組織 無細(xì)胞提取液破碎、抽提、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過濾疏水層析吸附層析四 蛋白質(zhì)的分離純化方法 分離提純蛋白質(zhì)的各種方法主要是利用蛋白質(zhì)之間的各種特異性的差異，包括： （1）分子大小； （2）溶解度； （3）電荷不同； （4）選擇

10、性吸附； （5）對配體分子的生物學(xué)親和力等。 （一）根據(jù)分子大小不同的純化方法 1 透析(dialysis)和超濾(ultrafiltration)2 凝膠過濾(gel filtration) 不同分子量的蛋白質(zhì)分子1 透析和超濾* 透析(dialysis)利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)大分子與其他小分子物質(zhì)分開的方法。* 超濾法 應(yīng)用正壓或離心力，使水和其他小分子通過半透膜而蛋白質(zhì)被截留在膜上，達(dá)到濃縮或脫鹽粗分級的目的。透析與超過濾簡易裝置超濾裝置（1）凝膠過濾的介質(zhì)2 凝膠過濾凝膠的網(wǎng)孔大小決定分離范圍能被該凝膠分離開來的蛋白質(zhì)混合物的相對分子質(zhì)量范圍Sephadex G-

11、50 1 50030 000 有時用排阻極限來表示分離范圍的上限,排阻極限指不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔的最小相對分子量,如Sephadex G-50的極限為30 000 常用的凝膠 : 葡聚糖凝膠（商品名Sephadex）是由線型的-1,6-葡萄糖與1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷反應(yīng)而成,商品名為Sephadex 。聚丙烯酰胺凝膠(商品名Bio-GelP)是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺共聚而成，商品名為Bio-Gel P。瓊脂糖凝膠(Sepharose，Bio-gel A)是從瓊脂中分離制得的，商品名為Sepharose或Bio-Gel A交聯(lián)葡聚糖凝膠 Sephadex瓊脂糖凝膠 Sepharo

12、se以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，將丙烯酰胺（單體）聚合而成聚丙烯酰胺凝膠 （Bio-gel P）(2)凝膠過濾的原理床體積（Vt）膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（Vt） 外水體積（Vo）：凝膠珠孔隙的水相體積內(nèi)水體積（Vi）:凝膠珠內(nèi)部的水相體積 基質(zhì)體積（Vm）：基質(zhì)自身具有的體積 洗脫體積（Ve）：自加樣開始到該組分的洗脫峰出現(xiàn)時所流出的體積。 關(guān)系：VtVoViVg 由于Vg相對很小，可以忽略不計(jì)，則有：VtVoVi 物質(zhì)在凝膠層析柱被排阻的范圍均在均在0100之間，被排阻的程度由可用分配系數(shù)Kav表示Kav:分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系KavVeV0VtV0分離物分子質(zhì)量大

13、，Kav值小，反之，則增大 Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。對于完全排阻的大分子，洗脫體積VeVo，Kav=0；對于完全滲透的小分子，洗脫體積VeVt，Kav=1；分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間，0Kav1。Kav既是判斷分離效果的參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子量的重要依據(jù)。應(yīng)用凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質(zhì)、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質(zhì)。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些物質(zhì)的溶液進(jìn)行脫鹽、去熱源和脫色。（二）根據(jù)溶解度差別純化的方法 影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素主要有：（1）溶液的pH，（2）離子強(qiáng)

14、度I，（3）介電常數(shù)，（4）溫度T。 根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，適當(dāng)改變上述外界因素，就可以選擇性的控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，作為分離純化蛋白質(zhì)的一種手段。1. 等電點(diǎn)沉淀和pH控制 2. 鹽溶和鹽析 鹽溶(salting in)指的是低濃度的中性鹽可以增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象。鹽析(salting out)指的是當(dāng)中性鹽的離子強(qiáng)度增加到足夠高時，（如飽和或半飽和的程度），很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來的現(xiàn)象。 常用鹽析鹽類： (NH4)2SO4 ，NaCl等鹽溶原理示意圖鹽溶主要由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用卻加強(qiáng)。鹽

15、析原因：在蛋白質(zhì)溶液中大量加入中性鹽使水的活度降低，原來溶液中大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層鹽析原理示意圖應(yīng)用 鹽析是一種最常用的分級分離的方法之一,利用好了一步即能除去大量的雜蛋白.現(xiàn)在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都已經(jīng)利用鹽析進(jìn)行了沉淀并結(jié)晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白酶等優(yōu)點(diǎn):保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象,能再溶解下面以卵清蛋白的分離為例看:雞蛋清球蛋白沉淀濾液卵清蛋白晶體半飽和(NH4)2SO43. 有機(jī)溶劑分級法 與水互溶的有機(jī)溶劑（如乙醇和丙酮）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低， 原因之一是降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，蛋

16、白質(zhì)表面的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀； 原因之二與鹽析相似，有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集沉淀。有機(jī)溶劑分級分離原理示意圖4 溫度對溶解度的影響 在低離子強(qiáng)度時，蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)在一定范圍（約0-40）內(nèi)是隨著溫度增加而增加的。但在40-50以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性介質(zhì)中就會失去溶解力。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定。因此，蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都要求在低溫下進(jìn)行。（三）根據(jù)電荷不同的分離方法 1 . 電泳 電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率不同，在電泳時可以分開。 F=F

17、fqE=fV=v/E泳動度電泳的發(fā)展a. 自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。 b. 區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。 1）紙電泳：用濾紙作支持物。 2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 Protein DenaturedPartialDenatured濾紙電泳 Cellulose薄層電泳 (TLE) Cellulose acetate膠體 Starch Gel 電泳形式的演進(jìn)圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。平板電泳：鋪有凝膠的平板上進(jìn)行的電泳。+ -+ 純化中應(yīng)用最多的是聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，它們既可以作

18、為蛋白質(zhì)純度檢驗(yàn)方法，也可以純化、制備蛋白質(zhì)。 （1） PAGE：PAGE電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的電泳凝膠板分為兩部分：濃縮膠分離膠PAGE垂直平板電泳示意圖高效的分辨率濃縮效應(yīng)電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)PAGE的三種分離效應(yīng)1. 加入 Seperating gel約232. 立即加入蒸餾水2 ml以壓平膠體 蒸餾水Separating gel分離膠的制備Separating gelStacking gelcomb1.加入 stacking gel2. 插入comb 注意：濃縮膠要加滿插入comb 時要注意避免有氣泡濃縮膠的制備Separating gelStacking gel垂直電泳Bu

19、fferdye加樣（2）等電點(diǎn)聚焦蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)當(dāng)pH=pI時凈電荷為零，在電場中既不向正極也不向負(fù)極移動，此時的pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體，在電場作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動，形成pH梯度，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其pI的pH處，即不再泳動而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectric focusing，IEF)原理: 等電聚焦的運(yùn)作機(jī)制：-+pH357911+-+-+-+-+-+-（3）雙向凝膠電泳 2.離子交換層析法 不同載體： 離子交換纖維素 離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應(yīng) 離子交換交聯(lián)瓊脂糖+-an

20、ion exchange beadEquilibrationSample applicationand wash-+-Elution-+-Regeneration-+離子交換劑的構(gòu)成纖維素O-CH2COO-Na+基質(zhì) 功能基團(tuán) 反離子 羧甲基離子交換劑組成DEAE anion exchanger陰離子交換基強(qiáng)堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素CMC Cation Exchanger陽離子交換基強(qiáng)酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂離子交換劑親和層析法(AC) （七）利用對配體的特異生物學(xué)親和力 的純化方法 Pr瓊脂糖小珠配體：凝集素，抗原，抗體金屬螯合劑

21、雜質(zhì)雜質(zhì)蛋白質(zhì) 配體 蛋白質(zhì)配體復(fù)合物配體的選擇可選擇配體的種類：抑制劑效應(yīng)物酶的輔助因子類似底物抗體其它（外源凝集素，PolyA， PolyU 金屬離子）（六） HPLC原理：，GF，吸附層析技術(shù)上的改進(jìn)顆粒力度小而均勻，機(jī)械性能強(qiáng)化學(xué)性能穩(wěn)定高壓柱，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)備分辨率提高，效率提高五蛋白質(zhì)相對分子量的測定1.凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量 Note：蛋白質(zhì)分子通過凝膠柱的速度并不直接取決于分子質(zhì)量，而是分子的半徑。因此用凝膠過濾法測定分子質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr）與待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（球形）分子形狀為線形或能與凝膠發(fā)生吸附作用的蛋白質(zhì)，不能用此法測定。將已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行過濾層析，在一定的范圍內(nèi)，各個組分的Ve與其分子量的對數(shù)成線性關(guān)系。 Veb lg MWc優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單，不要求復(fù)雜的儀器對待測樣品的純度要