山羊基因克隆實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1、 山羊基因克隆實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)第五組提取DNADNA檢測（電泳）目的DNA片段基因擴(kuò)增（PCR）DNA檢測（電泳）目的基因片段與載體連接大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備導(dǎo)入受體細(xì)胞與藍(lán)白斑篩選陽性克隆鑒定9.DNA測序一、DNA提取【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹恐笇?dǎo)DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】組織細(xì)胞被PK消化后，經(jīng)過萃取漂洗獲得純凈DNA?！緦?shí)驗(yàn)步驟】30mg組織，用眼科剪剪碎，加入200TLbuffer+20uLPK,55C水浴1-3h。加入220uLbufferBL,振蕩15s,70C放置10min,溶液變清亮。10000r離心2min,移上清液至新離心管。加220uL無水乙醇，充分振蕩

2、15s,可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。將溶液和絮狀物加入到吸附柱中，12000r離心30s,棄廢液。向吸附柱加入500uLWB,12000r離心30s,棄廢液。向吸附柱加入500uLwashbuffer,12000r離心30s,棄廢液，空濾一次。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈離心管，加入50uLTE,放置5min,12000r離心2min,備檢。二、DNA電泳檢測【實(shí)驗(yàn)原理】瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.16.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng)，此外，在弱堿性條件下，D

3、NA分子帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過介質(zhì)運(yùn)動(dòng)而相互分離。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結(jié)合的作用，利用EB染色，并通過紫外線激發(fā)即可觀察被分離DNA片段的位置?！緝x器與試劑】瓊脂糖、10XTAE電泳緩沖液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0）、載體緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，30%甘油）、溴化乙錠水溶液（10mg/ml）、凝膠槽、電泳儀【實(shí)驗(yàn)步驟】取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100C加熱溶解。平衡凝膠槽，放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離（一般高出底板0.51

4、mm）。鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50C左右倒入凝膠槽，膠厚一般為58mm。待膠徹底凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負(fù)極端，DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)），使液面高出凝膠23mm,小心拔出梳子。DNA樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）。打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長度有關(guān)，一般使用電壓不超過5v/cm。據(jù)指示染料移動(dòng)的位置，確定電泳是否終止（溴酚藍(lán)的涌動(dòng)距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間）。電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。三、目的DNA片段基因擴(kuò)增（PCR）方案1遺傳

5、學(xué)實(shí)驗(yàn)31，PCR擴(kuò)增基因片段方案2：【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私舛嗑酆厦告湻磻?yīng)DNA擴(kuò)增技術(shù)的基本原理和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，掌握PCR反應(yīng)基本技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是1986年由KallisMullis發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機(jī)制探查，法醫(yī)鑒定等方面。PCR技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各學(xué)科的研究發(fā)展。PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物

6、經(jīng)酶促合成特異的DNA片段的體外方法，由高溫變性，低溫退火和適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，然后反復(fù)進(jìn)行，使目的的DNA得以迅速擴(kuò)增，主要過程如圖6。置待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈DNA模板；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72C將單核苷酸從引物3端開始摻入，沿模板53方向延伸，合成DNA新鏈。由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)2530次周期之后，理論上可增加109倍，實(shí)際上可增加107倍。PCR技術(shù)具有操作簡便、省時(shí)、靈敏度高特異性強(qiáng)和對原始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于所用的TaqD

7、NA聚合酶缺乏53核酶外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯(cuò)誤核苷酸摻入，估計(jì)每9000個(gè)核苷酸會導(dǎo)致一個(gè)摻入錯(cuò)誤，不過InnisMA發(fā)現(xiàn)，錯(cuò)誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯(cuò)誤不會擴(kuò)大。Unamplified“湫primersleitatureaftdprifttroilnatUJSand原理示意圖aim電alprine1-5圖3-1PCR原理示意圖PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個(gè)共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。1、模板

8、：單、雙鏈DNA和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA,須先通過逆轉(zhuǎn)錄得取第一條CDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng量級的克隆DNA，ug級的染色體DNA，待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，TaqDNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)。2、引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)。（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC含量類似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3末端）的序列。（3）防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3末

9、端重疊的序列。（4）引物的長度約為20個(gè)堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。（5）引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體，而且擴(kuò)增微量靶目標(biāo)或起始材料是粗制品，容易產(chǎn)生非特異產(chǎn)物。3、緩沖液：PCR緩沖液的變化通常會影響擴(kuò)增結(jié)果，特別是MgCI2，其濃度對專一性和擴(kuò)增量有重大影響，通常最適濃度為1.5mM左右（每種dNTP的濃度為0.2mM時(shí)），濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物產(chǎn)量降低。四種dNTP濃度通常每種都是0.05mM0.2mM。過高的濃度會導(dǎo)致錯(cuò)誤摻入，濃度過低，則影響反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。四種dNTP濃度應(yīng)大體相同，其中一種若偏高，會誘發(fā)錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過

10、早終止延伸反應(yīng)。另外dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離Mg2+濃度降低，所以如果dNTP的濃度有很大改變，MgCl2濃度也要改變oTaq聚合酶是一種耐高溫聚合酶，用量通常是14單位/100ul,濃度過高，產(chǎn)生過多的非特異片段。4、循環(huán)參數(shù)：PCR循環(huán)是把起始材料加熱到9095C,保持短時(shí)間使雙鏈DNA解鏈；然后冷卻至3755C，使引物與模板退火；再升溫至7075C，在TaqDNA聚合酶的作用下?lián)饺雴魏塑账?，使引物沿模板延伸。解鏈不完全是?dǎo)致PCR失敗的最主要原因。用DNA擴(kuò)增儀時(shí)，94C保持1min可使模板的起始物完全變性。若用低于94C的條件，則應(yīng)適當(dāng)延長時(shí)間。引物與模板退火溫度由引物的長度及

11、G+C含量決定。適時(shí)間退火（12）min有利于產(chǎn)物的特異性。引物延伸在7075C保溫的時(shí)間可根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的長短來調(diào)節(jié)。正常情況下，每min可延伸1Kb的長度，常規(guī)PCR一般為2540個(gè)循環(huán)，若循環(huán)加長，則由于酶活性降低，聚合時(shí)間延長，引物及單核苷酸減少等原因，反應(yīng)后期容易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，所以在滿足產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少周期次數(shù)?！緝x器與試劑】一）儀器與器皿PRC擴(kuò)增儀（PE2400）,瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性指形管，凝膠成像儀,玻片（二）試劑與材料瓊脂糖凝膠電泳試劑：1）電泳緩沖液：Tris乙酸0.04mol/LPH8.00.002mol/LEDTA；2）加樣緩沖液：0.

12、25%溴酚蘭40%w/v蔗糖；3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水；4）瓊脂糖、TaqDNA多聚酶、5反應(yīng)緩沖液：125mmol/LTris-HClpH8.2；10mmol/LMgCl2；0.5mg/mlgelatin；125mmol/L（NH4）2SO4；Formamide25%、混合dNTP液（dATPdGTPdTTPdCTP各2mmol/L）、DNA模板（每2ml中含有10fg待擴(kuò)增DNA）、引物1（25pmol/L）,5加入EcoRI粘性末端堿基、引物2（25pmol/L）,5加入Hindlll粘性末端堿基、無菌水【實(shí)驗(yàn)步驟】按順序在200ml指形管中加入以下試劑與樣品。（

13、因購入的試劑批次不同，加樣時(shí)有所差別，以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)?？傮w積共100ml，也可以配成40ml的反應(yīng)體系）表3-1PCR所用試劑樣品及其用量試劑及樣品用量/mLddH2O7410Buffer10MgC12（10Buffer如已加入MgC12，則不必加）6dNTP2引物12引物22模板2TaqDNA聚合酶22.在PCR擴(kuò)增儀上按表3-2反應(yīng)條件編入程序（以下為參考值，因擴(kuò)增的DNA片段不同，各類PCR擴(kuò)增儀程序設(shè)定各不相同，編程過程視擴(kuò)增的DNA片段的要求及儀器而定）。表3-2PCR反應(yīng)參數(shù)條件循環(huán)條件（30次）預(yù)變性變性復(fù)性延伸溫度94C94C55C55C時(shí)間2min40s35s2min10s

14、延長延伸72C7min編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)孔中，開動(dòng)機(jī)器，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)開始。PCR擴(kuò)增完畢，配2%瓊脂糖凝膠，取15ml反應(yīng)液及相適應(yīng)的PCRmark分別點(diǎn)樣，加樣緩沖液應(yīng)為40%W/V蔗糖，電泳觀察結(jié)果。凝膠成像儀或紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否已擴(kuò)增到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的DNA片段。四、DNA電泳檢測（具體方案見實(shí)驗(yàn)2）五、目的基因片段與載體連接【實(shí)驗(yàn)原理】克隆載體（T載體）：重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連

15、接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：首先，T4DNA連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5磷酸基和3羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。很多DNA聚合酶在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)會在PCR產(chǎn)

16、物雙鏈DNA每條鏈的3端加上一個(gè)突出的堿基AopUCm-T載體是一種已經(jīng)線性化的載體，載體每條鏈的3端帶有一個(gè)突出的T?！緋UCm-T載體（pUCm-TVector）是用于克隆含有A末端PCR產(chǎn)物的理想載體?！窟@樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產(chǎn)物的兩端進(jìn)行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。連接反應(yīng)的溫度在37C時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16C，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。【儀器與試劑

17、】旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面離心管架，臺式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。T載體，T4DNA連接酶，連接酶緩沖液，無菌ddWater【實(shí)驗(yàn)步驟】采用膠回收試劑盒回收2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后的目的條帶（目的基因）。PCR產(chǎn)物與T載體直接連接：事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在1416C。取4個(gè)滅菌的200UL微量離心管，加入（需要調(diào)整）：4UL目的基因、1ULT載體、0.5ULT4DNA連接酶（TAKARA,350U/ul）、1UL連接酶緩沖液10 xbuffer、3.5ULddWater；總量10uL體系上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C干式恒

18、溫儀（或14C水中）中保溫過夜（12-16h）。4連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4C冰箱備用。六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)菌在0CCaCl2低滲溶液中膨脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的感受態(tài)?！緝x器與試劑】旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50mL微量離心管，1.5mL微量離心管，臺式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp）,酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，濾膜和過濾器E.coli菌種，LB培養(yǎng)基，0.1mol/LCaCl2溶液，無菌ddWater，L

19、B培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddwater，IPTG，X-gal?！緦?shí)驗(yàn)步驟】在超凈工作臺中，將1mL大腸桿菌菌液加入100mLLB液態(tài)培養(yǎng)基（不含抗菌素）,37C搖床培養(yǎng)過夜。取0.5mL上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50mLLB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37C下250r/min搖床培養(yǎng)23h,測定OD590為0.350.4左右（0.40.6，細(xì)胞數(shù)108/mL,此為關(guān)鍵參數(shù)）。（注意：此步搖菌的時(shí)候，要有一管不加菌的LB培養(yǎng)液同時(shí)搖菌）將1mL菌液加入到4支1.5mL預(yù)冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min,然后于4C,5000r離心5min。將離心管倒置以倒盡上清液，加入1m

20、L冰冷的0.1mol/LCaCI2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。5.4C,5000r離心5min,棄上清液后，用100UL冰冷的0.1mol/LCaCI2溶液垂懸，插入冰中放置2h,可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入-4C冰柜中保藏。七、導(dǎo)入受體細(xì)胞與藍(lán)白斑篩選【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆漳康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞的方法、了解藍(lán)白斑篩選法?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)菌在低溫下經(jīng)CaCI2溶液處理，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，提高了膜的通透性，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA,形成抗DNase的羧基-鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面上，經(jīng)42C短時(shí)間熱沖擊處理，會使受體細(xì)菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生出一種短暫的感受態(tài)。在此期間它們能夠攝取各種

21、不同來源的DNA,如入噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA等。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌的繁殖速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能夠獲得大量的目的基因。一些載體（如PUC系列質(zhì)粒）帶有B-半乳糖苷酶（lacZ）N端a片段的編碼區(qū)，該編碼區(qū)中含有多克隆位點(diǎn)（MCS）,可用于構(gòu)建重組子。這種載體適用于僅編碼B-半乳糖苷酶C端s片段的突變宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有半乳糖苷酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，a片段與s片段可通過a-互補(bǔ)形成具有酶活性的B-半乳糖苷酶。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)。由a-互補(bǔ)而產(chǎn)

22、生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落。而當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地破壞a片段的編碼，使得帶有重組質(zhì)粒的LacZ-細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，稱為藍(lán)白斑篩選?！緝x器與試劑】（一）儀器及工具超凈工作臺，高速離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫水浴鍋，消毒離心管（EP管），玻璃培養(yǎng)皿，玻璃涂布器，標(biāo)記筆。（二）試劑LB液體培養(yǎng)基：00mL去離子水中加入10g胰蛋白胨,5g酵母提取物，10gNaCI,待完全溶解后，定容至1000mL,高壓滅菌后備用。LB固體培養(yǎng)基：取已配制好的LB液體培養(yǎng)基100mL,加入1.5g

23、瓊脂粉，攪拌至溶解,高壓滅菌后置于超凈臺冷卻后備用。X-gal：用二甲基甲酰胺溶液溶解至濃度為20mg/mL的儲存液，小份分裝后用錫紙包裹貯存于-20保存?zhèn)溆?。IPTG：用10mL滅菌雙蒸水溶解100mgIPTG,濾膜過濾除菌，分裝后凍存于-20保存?！緦?shí)驗(yàn)步驟】在無菌條件下取將100感受態(tài)細(xì)胞置于無菌的1.5mL消毒離心管（EP管）中，加入目標(biāo)基因5,輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物。置于冰上放置30min；將盛有連接產(chǎn)物的離心管置于42C恒溫水浴鍋中，熱擊90s后，冰上放置12min；在上述離心管中加入500的LB液體培養(yǎng)基；5.37C搖床以150r/min培養(yǎng)1.5h；取200涂布于含有IPTG（異

24、丙基硫代-B-D-半乳糖苷）和X-gal的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻；室溫放置10min后，倒置培養(yǎng)1216h至單菌落形成；挑取白色菌落接種于盛有1mLLB液體培養(yǎng)基的1.5mLEP管中，37C搖床培養(yǎng)過夜。八、陽性克隆鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)大腸桿菌轉(zhuǎn)化陽性克隆的鑒定，學(xué)習(xí)堿法提取質(zhì)粒DNA的方法和技術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞后，還需要對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用a互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用是最常用的一種鑒定方法?，F(xiàn)在使用的許多載體（如pUC系列）都帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有B-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和B-半乳糖苷酶a肽鏈氨基端（146個(gè)氨基酸

25、）的編碼信息。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端，而不影響功能。這種載體適用于可編碼B-半乳糖苷酶C端部分序列（s片段）的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。堿法提取質(zhì)粒是基于細(xì)菌染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性特征而達(dá)到分離目的的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒復(fù)性迅速

26、而準(zhǔn)確，而細(xì)菌染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，細(xì)菌染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物以及細(xì)菌碎片等一起沉淀下來而被除去?！緝x器與試劑】（一）儀器恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺式離心機(jī)、高壓滅菌鍋等。（二）試劑上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒【實(shí)驗(yàn)步驟】1將培養(yǎng)好的12mL細(xì)菌12,000r離心15s,去上清。加100SolutionI,用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。加入200SolutionII，立即上下顛倒510次，使細(xì)菌裂解，室溫放置2min。加入350Solution

27、III，立即上下顛倒510次，使之充分中和，室溫放置2min。12,000r離心，5min。將步驟5中的上清轉(zhuǎn)移到套放于2.0mL收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，10,000r室溫離心15s。7棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一只收集管中，吸取500ylLWashSolution到UNIQ-10柱，10,000r室溫離心30s。8.重復(fù)步驟7。9棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一只收集管中，10,000r室溫離心30s以徹底去除WashSolution。10.將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5mL離心管中，加50DW（或ElutionBuffer），室溫放置2min后，10

28、,000r室溫離心1min。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。九、DNA測序【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆针p脫氧鏈終止法測定DNA序列的原理與方法【實(shí)驗(yàn)原理】DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3-OH末端上進(jìn)行的。由于2,3-雙脫氧三磷酸核苷酸（ddNTP）的3-位脫氧而失去游離-OH,當(dāng)它參入到DNA鏈后，3-OH末端消失，使DNA鏈的延伸終止。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)此原理，將待測DNA片段插入單鏈?zhǔn)删wM13載體，并用合成的寡聚核苷酸引物與該載體上插入待測片段的上游順序退火，隨后在T7DNA聚合酶催化下進(jìn)行延伸反應(yīng)。實(shí)際操作中同時(shí)進(jìn)行，分別終止于A、G、C和T的4個(gè)反應(yīng)體系。每個(gè)反應(yīng)體系均含4種脫氧三磷酸核苷酸

29、（dNTP）底物，其中一種dATP為32P標(biāo)記物，以便能用放射自顯影法讀序。但在這4個(gè)反應(yīng)體系中，分別加一種低濃度的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP），這樣ddNTP可隨機(jī)參入正在延伸的DNA鏈上，使鏈延伸終止。例如在“A”管中加ddATP，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，管內(nèi)所有新合成的DNA鏈都是以A結(jié)尾的不同長度的片段，而且這些片段都帶放射性。將反應(yīng)物加在高分辨凝膠上電泳，DNA片段則因其長度不同（分子量大小不同）被分離，短的走在前端，長的泳動(dòng)在后面。其他3管則分別為以G，C或T結(jié)尾的不同長度DNA片段。由于：即使是長短相差一個(gè)核苷酸的DNA片段，亦可根據(jù)其電泳距離的差異而加以區(qū)分

30、；A、G、C和T4種反應(yīng)體系的產(chǎn)物在電泳凝膠中相鄰排列。故而在閱讀凝膠電泳的放射自顯影圖像時(shí)，由下至上按前后順序即可將DNA的核苷酸順序讀出。常用方法有如下3種（其中分析一種測序方法：雙脫氧鏈終止法測定DNA序列）方法1、末端終止法2、化學(xué)裂解法3、DNA測序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。差1個(gè)核苷酸的ssDNA,從而完成測序的方法?？芍弊xDNA順序。優(yōu)點(diǎn)簡

31、便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序1、高負(fù)荷，1塊膠可測16個(gè)樣品；2、機(jī)讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。實(shí)驗(yàn)步驟】1單鏈模板與引物退火用無菌蒸餾水按1：5稀釋通用引物(約4.44陰/mL)。取1.5mL微量離心管1只，加入下列試劑：模板DNA(1.5-2ugDNA/10叫10；稀釋通用引物2；退火緩沖液2,總體積14。2鏈延伸/終止反應(yīng)稀釋T7DNA聚合酶：取2叫或4叫冷的酶稀釋緩沖液至1只微量離心管中，加入0.5(或l)T7DNA聚合酶，用加樣器輕輕抽吸和排出而混勻，置冰浴中待用。另取4只微量離心管，分別用記號筆標(biāo)明A”、“G”、“C”和“T

32、”。依次將A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5分別加入這4只微量離心管中，置37C預(yù)溫1min以上(說明：4種mix液各又分為short和long兩種，前者中ddNTP濃度較高，用于500bp的DNA片段的測序，后者用于50-1000bp片段的測序。一般應(yīng)用short即可)。標(biāo)記反應(yīng)：在操作(1)的微量離心管中加入下列試劑：模板/引物14(已有)；標(biāo)記用混合物(1abellingmix)31；已標(biāo)記混合物(1abelledmix)11,T7DNA聚合酶稀釋液21?？傮w積201。輕輕混勻，簡短離心，置室溫5min，立即接下步反應(yīng)。從“標(biāo)記反應(yīng)混合物中，分別取4.5加于4只預(yù)溫的反應(yīng)液中(注意：每一次轉(zhuǎn)移均應(yīng)換用新的吸頭)，輕輕混勻。簡短離心，37C保溫5min。向每只離心管中加入5反應(yīng)終止液，混勻，簡短離心。變性反應(yīng)：在電泳前進(jìn)行。在上述鏈延伸反應(yīng)終止后，最好即時(shí)進(jìn)行變性反應(yīng)并電泳，如不能及時(shí)電泳，終止反應(yīng)后樣品可儲于冰浴或4C。另取4只微量離心管，標(biāo)好“A、“G”、C”和“T”。從上述每一鏈延長/終止反應(yīng)的試管中取31，分別加入4只已標(biāo)號的相應(yīng)微量離心