飛蝗細(xì)胞色素P450基因的分子特性及功能研究(共9頁(yè))

1、飛蝗細(xì)胞色素P450基因的分子(fnz)特性及功能研究【摘要】：細(xì)胞色素P450基因是最龐大的超基因家族之一,存在于幾乎所有的生物體內(nèi)。在昆蟲(chóng)體內(nèi),細(xì)胞色素P450作為一種重要的代謝酶系,可以代謝多種殺蟲(chóng)劑及植物次生代謝物質(zhì)。細(xì)胞色素P450功能的多樣性是由其基因的多樣性決定的。目前已有超過(guò)1000個(gè)昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因被識(shí)別和鑒定,數(shù)目還在不斷增加。飛蝗是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),對(duì)其生理生化、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)及有效控制等方面的研究具有重要意義。本文對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究,從分子水平揭示飛蝗不同家族細(xì)胞色素P450基因的組織、發(fā)育階段及殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)表達(dá)特性,通過(guò)RNA干擾技術(shù)

2、研究飛蝗細(xì)胞色素P450基因?qū)⑾x(chóng)劑的代謝解毒機(jī)制,主要研究結(jié)果如下：1、飛蝗細(xì)胞色素P450基因的搜索及其分子特性研究采用生物信息學(xué)方法(fngf),根據(jù)昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的保守區(qū)(motif),對(duì)飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了全面搜索,并對(duì)獲得的細(xì)胞色素P450的ESTs進(jìn)行了拼接和注釋。獲得15個(gè)細(xì)胞色素P450基因片段,分別命名為L(zhǎng)mP450-1-15。采用RT-PCR檢測(cè)了15個(gè)細(xì)胞色素P450基因在五齡飛蝗不同組織部位和發(fā)育階段的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞色素P450基因主要在中腸、胃盲囊和脂肪體表達(dá),少部分主要在馬氏管和后腸表達(dá),極少數(shù)在前腸有明顯表達(dá)；飛蝗細(xì)胞色素P450基因在三、四齡

3、表達(dá)較高,而在卵這一階段相對(duì)表達(dá)較少。采用三種殺蟲(chóng)劑(溴氰菊酯、馬拉硫磷和西維因)對(duì)三齡飛蝗進(jìn)行了劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明：三種殺蟲(chóng)劑在不同濃度處理?xiàng)l件下,只有(zhyu)在溴氰菊酯濃度為L(zhǎng)D10和LD30分別引起細(xì)胞色素P450酶活性升高1.33倍和1.70倍,而用馬拉硫磷和西維因處理蟲(chóng)體后,細(xì)胞色素P450酶活性沒(méi)有明顯的變化。溴氰菊酯處理三齡飛蝗12h,酶活性最高。進(jìn)一步研究點(diǎn)滴溴氰菊酯不同時(shí)間,細(xì)胞色素P450基因表達(dá)量的變化,結(jié)果表明：大多數(shù)基因在溴氰菊酯處理12h表達(dá)量最高,表明細(xì)胞色素P450酶活性的增高是由于基因表達(dá)量增加的結(jié)果。2、飛蝗細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)序列克隆

4、通過(guò)RACE-PCR方法,對(duì)15個(gè)飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段進(jìn)行5和3-RACE擴(kuò)增,獲得2個(gè)細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)序列,由細(xì)胞色素P450國(guó)際命名委員會(huì)分別命名為CYP409A1和CYP408B1,并確定為兩個(gè)新家族基因。采用生物信息學(xué)方法對(duì)飛蝗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了全面搜索,并對(duì)獲得的細(xì)胞色素P450基因序列進(jìn)行克隆,共獲得6個(gè)細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)序列,由細(xì)胞色素P450國(guó)際命名委員會(huì)分別命名為CYP6FD1、CYP6FD2、CYP6FE1、CYP6FF1、CYP6FG1和CYP9AQ2.將8個(gè)飛蝗細(xì)胞色素P450氨基酸序列與果蠅的細(xì)胞色素P450s進(jìn)行聚類,結(jié)果顯示,除CYP409

5、A1和CYP408B1兩個(gè)新家族成員外,其它各家族基因均與果蠅的同一家族成員聚為一簇。8個(gè)飛蝗細(xì)胞色素P450基因均屬于CYP3族(Clan)的成員,該族成員與藥物及外源物質(zhì)的代謝相關(guān)。3、飛蝗細(xì)胞色素P450基因的發(fā)育階段及組織特異表達(dá)采用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)了8個(gè)飛蝗細(xì)胞色素P450基因在不同發(fā)育階段的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CYP409A1、CYP6FG1和CYP9AQ2三個(gè)基因在卵階段mRNA的表達(dá)與其它發(fā)育階段相比表達(dá)量較低。而CYP6FD1、CYP6FD2和CYP6FE1在卵階段幾乎沒(méi)有表達(dá),CYP6FD1在四齡表達(dá)最高,一齡到三齡次之；CYP6FD2表達(dá)較為特殊,僅在成蟲(chóng)期高表達(dá)；

6、CYP6FE1在四齡表達(dá)量最高,五齡和成蟲(chóng)次之。CYP408B1和CYP6FF1在飛蝗各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)。采用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)了8個(gè)飛蝗細(xì)胞色素P450基因在飛蝗五齡若蟲(chóng)不同組織部位的表達(dá),結(jié)果顯示：CYP409A1在所有組織中都有表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)弱有所不同,馬氏管表達(dá)量最高,胃盲囊和脂肪體表達(dá)量次之,血淋巴和肌肉中表達(dá)量最低。CYP408B1在前腸高表達(dá),后腸、脂肪體、肌肉和腦中也有一定的表達(dá)。除血淋巴外,CYP9AQ2在其余組織部位均有較高的表達(dá),前腸表達(dá)量最高。CYP6家族的5個(gè)基因在脂肪體或馬氏管表達(dá)量最高。4、溴氰菊酯對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)采用Real-

7、timePCR對(duì)不同濃度溴氰菊酯處理飛蝗后細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：CYP409ALCYP6FD2,CYP6FF1和CYP6FG1均表現(xiàn)為低劑量誘導(dǎo)的趨勢(shì),與對(duì)照相比,在溴氰菊酯LD10劑量下,其mRNA表達(dá)量提高了1.7-2.0倍。CYP9AQ2在溴氰菊酯三個(gè)劑量作用下都有高表達(dá),為對(duì)照的2.26-2.55倍。CYP408B1和CYP6FE1的表達(dá)情況在溴氰菊酯處理前后沒(méi)有顯著的變化。只有CYP6FD1基因mRNA的表達(dá)受到抑制,且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì),隨著濃度的增加mRNA表達(dá)量逐漸下降。采用溴氰菊酯處理飛蝗4、8、12、24和48h,除CYP408B1和CYP6FD1外

8、,大多數(shù)細(xì)胞色素P450基因在溴氰菊酯處理后表現(xiàn)出不同程度的誘導(dǎo)作用,在溴氰菊酯處理飛蝗12h其誘導(dǎo)表達(dá)量與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照相比可達(dá)1.2-6.7倍。CYP408B1和CYP6FD1經(jīng)溴氰菊酯處理不同時(shí)間后其mRNA表達(dá)呈現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象,前者在48h表達(dá)量最低,后者在8h表現(xiàn)出最低的表達(dá)量。5、基于RNAi的飛蝗細(xì)胞色素P450基因功能研究本研究發(fā)現(xiàn)在分別注射CYP409A1、CYP408B1、CYP6FF1和CYP9AQ2等4個(gè)細(xì)胞色素P450基因dsRNA后點(diǎn)滴溴氰菊酯,與注射dsGFP后點(diǎn)滴溴氰菊酯相比,飛蝗的死亡率明顯提高,表明這4個(gè)基因在飛蝗對(duì)溴氰菊酯的代謝中起著關(guān)鍵作用。分別注射CY

9、P6FD2和CYP6FE1基因dsRNA后點(diǎn)滴西維因,與注射dsGFP的對(duì)照相比,飛蝗的死亡率明顯提高,表明CYP6FD2和CYP6FE1基因可能參與飛蝗對(duì)西維因的代謝。分別注射8個(gè)細(xì)胞色素P450基因特異dsRNA后點(diǎn)滴馬拉硫磷或DDT,與注射dsGFP的對(duì)照相比,飛蝗的死亡率均未見(jiàn)顯著性差異,表明本研究中獲得的8個(gè)細(xì)胞色素P450全長(zhǎng)基因可能并不涉及馬拉硫磷或DDT的代謝。6、飛蝗細(xì)胞色素P450基因的原核表達(dá)本研究試圖以CYP409A1和CYP408B1為例,建立飛蝗細(xì)胞色素P450基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果表明：我們成功構(gòu)建了pET28a-CYP409A1和pET28a-CYP408B

10、1兩種重組蛋白。但遺憾的是對(duì)兩種重組蛋白在大腸桿菌宿主細(xì)胞中未獲表達(dá)。綜上所述,本研究基于飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)獲得15個(gè)細(xì)胞色素P450基因片段,并進(jìn)行了初步的分子特性研究,為進(jìn)一步研究飛蝗細(xì)胞色素P450提供了新的資料；通過(guò)克隆獲得8個(gè)飛蝗細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)序列,為深入研究飛蝗細(xì)胞色素P450基因結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)；采用Real-timePCR技術(shù)系統(tǒng)分析了8個(gè)細(xì)胞色素P450基因在飛蝗不同發(fā)育階段、不同組織部位及溴氰菊酯誘導(dǎo)下的表達(dá)特性,并基于RNAi探討了飛蝗細(xì)胞色素P450基因與殺蟲(chóng)劑代謝的關(guān)系；另外,還初步進(jìn)行了飛蝗細(xì)胞色素P450基因的大腸桿菌表達(dá)研究。研究結(jié)果將為進(jìn)一步開(kāi)

11、展飛蝗細(xì)胞色素P450的生物學(xué)功能和生理生化特性提供了資料,對(duì)于探討飛蝗體內(nèi)細(xì)胞色素P450對(duì)殺蟲(chóng)劑的代謝解毒機(jī)理具有重要的意義,為基于細(xì)胞色素P450基因研究的蝗蟲(chóng)有效控制提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)也為豐富細(xì)胞色素P450的整體研究體系作出一定貢獻(xiàn)?！娟P(guān)鍵詞】：飛蝗細(xì)胞色素P450表達(dá)序列標(biāo)簽殺蟲(chóng)劑RNA干擾【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：博士【學(xué)位授予年份】：2012【分類號(hào)】：Q963【目錄】：中文摘要13-16ABSTRACT16-21第一章前言21-431.1細(xì)胞色素P450與細(xì)胞色素P450酶系21-241.1.1細(xì)胞色素P450211.1.2細(xì)胞色素P450酶系21-221.1.

12、3細(xì)胞色素P450的命名22-231.1.4細(xì)胞色素P450的結(jié)構(gòu)特征23-241.2昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的多樣性及其進(jìn)化24-271.2.1種類的多樣性24-261.2.2分布的多樣性261.2.3催化反應(yīng)的多樣性261.2.4細(xì)胞色素P450的進(jìn)化26-271.3昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的功能27-341.3.1內(nèi)源物質(zhì)的代謝28-301.3.2外源物質(zhì)的代謝30-341.4昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)與誘導(dǎo)34-351.4.1昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)特性341.4.2昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的誘導(dǎo)34-351.5昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的研究方法35-401.5.1昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基

13、因的克隆策略35-381.5.2昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的異源表達(dá)系統(tǒng)38-401.6飛蝗概述40-421.6.1飛蝗的分布與為害401.6.2飛蝗的研究進(jìn)展40-421.7本研究的立題依據(jù)及主要研究?jī)?nèi)容42-43第二章飛蝗細(xì)胞色素P450基因EST序列的獲得及其特性分析43-592.1研究材料43-452.1.1供試?yán)ハx(chóng)43-442.1.2主要試劑442.1.3主要儀器44-452.2研究方法45-502.2.1飛蝗EST數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)胞色素P450基因的搜索452.2.2飛蝗細(xì)胞色素P450基因PCR引物設(shè)計(jì)452.2.3RT-PCR分析細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)特性45-482.2.4殺蟲(chóng)劑對(duì)飛

14、蝗細(xì)胞色素P450的影響48-502.3結(jié)果與分析50-562.3.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段的獲得50-522.3.2基于RT-PCR的細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)特性分析52-532.3.3殺蟲(chóng)劑對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450的影響53-562.4討論56-59第三章飛蝗細(xì)胞色素P450基因克隆59-823.1研究材料59-603.1.1供試?yán)ハx(chóng)593.1.2主要試劑59-603.1.3主要儀器603.2研究方法60-673.2.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因cDNA全長(zhǎng)的獲得60-653.2.2飛蝗細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)cDNA的驗(yàn)證65-673.2.3飛蝗細(xì)胞色素P450基因序列分析673.2

15、.4飛蝗細(xì)胞色素P450的聚類分析673.3結(jié)果與分析67-803.3.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及命名67-683.3.2飛蝗細(xì)胞色素P450基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析68-793.3.3飛蝗細(xì)胞色素P450的聚類分析79-803.4討論80-82第四章飛蝗細(xì)胞色素P450基因的發(fā)育和組織表達(dá)特異性82-904.1研究材料82-834.1.1供試?yán)ハx(chóng)824.1.2主要試劑824.1.3主要儀器82-834.2研究方法83-854.2.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因Real-timePCR引物設(shè)計(jì)834.2.2飛蝗細(xì)胞色素P450基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)83-844.2.3

16、飛蝗細(xì)胞色素P450基因在不同組織部位的表達(dá)84-854.3結(jié)果與分析85-884.3.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因不同發(fā)育階段的表達(dá)分析854.3.2飛蝗細(xì)胞色素P450基因不同組織部位的表達(dá)分析85-884.4討論88-90第五章溴氰菊酯對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)90-975.1研究材料905.1.1供試?yán)ハx(chóng)905.1.2主要試劑905.1.3主要儀器905.2研究方法90-925.2.1實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備90-915.2.2總RNA的提取、純化及cDNA第一鏈的合成915.2.3Real-timePCR分析溴氰菊酯對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響915.2.4數(shù)據(jù)分析91-925

17、.3結(jié)果與分析92-955.3.1不同濃度溴氰菊酯對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)925.3.2溴氰菊酯處理飛蝗不同時(shí)間后細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)92-955.4討論95-97第六章飛蝗細(xì)胞色素P450基因的解毒功能分析97-1066.1研究材料97-986.1.1供試?yán)ハx(chóng)976.1.2主要試劑97-986.1.3主要儀器986.2研究方法98-1016.2.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因dsRNA引物設(shè)計(jì)及體外合成98-1006.2.2飛蝗細(xì)胞色素P450基因沉默效率及交叉干擾檢測(cè)1006.2.3細(xì)胞色素P450基因沉默后飛蝗對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性分析100-1016.3結(jié)果與分析101-1

18、046.3.1飛蝗細(xì)胞色素P450基因沉默效率及交叉干擾分析101-1026.3.2細(xì)胞色素P450基因沉默后飛蝗對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性分析102-1046.4討論104-106第七章飛蝗細(xì)胞色素P450基因的原核表達(dá)106-1147.1研究材料106-1077.1.1供試?yán)ハx(chóng)1067.1.2主要試劑106-1077.1.3主要儀器1077.2研究方法107-1107.2.1飛蝗CYP409A1和CYP408B1蛋白表達(dá)引物設(shè)計(jì)1077.2.2PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)107-1087.2.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化1087.2.4雙酶切及連接反應(yīng)108-1097.2.5轉(zhuǎn)化109-1107.2.6重組質(zhì)粒的表達(dá)1107.2.7重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1107.2.8表達(dá)產(chǎn)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)檢測(cè)1107.3結(jié)果與分析110-1127.3.1飛蝗CYP409A1和CYP408B1蛋白全長(zhǎng)表達(dá)驗(yàn)證110-1117.3.2飛蝗CYP409A1和CYP408B1基因重組表達(dá)載體的檢測(cè)1117.3.3SDS分析CYP409A1和CYP408B1在大腸