植物激素免疫測定指南

1、植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）免疫測定是利用抗原、抗體特異性反應而建立的，根據(jù)可視化方法的不同可分為：酶聯(lián)免疫、 放射免疫、熒光免疫、化學發(fā)光免疫測定、生物發(fā)光免疫測定、濁度免疫測定法等。由于酶聯(lián)免疫 吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays,簡稱ELISA）具有靈敏性、特異性高，且方 便、快速、安全、成本低廉的特點，而日益被廣泛應用于植物激素測定。目前，幾大類植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相應的ELISA方法并有試劑盒出售。植物激素的酶聯(lián)免疫檢測方法有兩種形式（見下圖），一種是在固相載體上直接包被

2、抗體（直接法， 先包被二抗，再加一抗），另一種是包被抗原（間接法）。直接法利用游離抗原和酶標抗原與吸附的抗體進行競爭。間接法利用游離抗原和吸附抗原與游離 抗體進行競爭。間接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗體，H表示游離激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白質(zhì)復合物。根據(jù)質(zhì)量作用 定律，當該反應體系中Ab及HP的量確定時，游離H越多，結(jié)合物AbH形成的就越多，而AbHP形成 的就越少，即結(jié)合在板上的抗體就越少，通過酶標二抗檢測結(jié)合物AbHP的多少，就可以確定游離H 量的多少。材料、試劑及設備1材料各種新鮮植物材料2儀器設備研缽，冷凍離心機，臺式快速離心濃縮干燥器

3、或氮氣吹干裝置，酶聯(lián)免疫分光光度計，吸水紙， 恒溫箱，冰箱，酶標板（40孔或96孔），可調(diào)微量液體加樣器（10p l，40p l,200p l,1000p l）， 帶蓋瓷盤（內(nèi)鋪濕紗布）。3試劑（1）包被緩沖液：稱取1. 5 g Na2CO3, 2.93g NaHCO3 0.2g NaN3 （可不加），用量筒加1 000 ml蒸餾水，pH為9.6.（2）磷酸鹽緩沖液（PBS）:稱取 8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 ,2.96g Na2HPO4 - 12H2O，用量筒加1 000 ml 蒸餾水，pH 為 7.5。（3）樣品稀釋液：100 ml PBS中加0.1 ml Tween-2

4、0，0.1g明膠（稍加熱溶解）。（4）底物緩沖液：稱取5.10gCHO HO（檸檬酸），18.43g Na HPO12HO,溶解定容至1 000ml，6 8 72242再加 1 ml Tween-20， pH 為 5.0。（5）洗滌液：1000ml PBS 加 1mlTween-20。（6）終止液：2mol/L H2SO4。（7）提取液：80%甲醇，內(nèi)含1 mmol/L BHT（二叔丁基對甲苯酚，為抗氧化劑，先用甲醇溶解 BHT，在配成80%的濃度）。（8）激素包被抗原、各激素抗體和標準物。（9）酶標二抗：辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔抗體。操作步驟樣品中激素的提?。?） 稱取0.5-1

5、.0g新鮮植物材料（若取樣后材料不能馬上測定，用液氮速凍后保存在-20C的低 溫冰箱中），加2ml樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10ml試管，再用2ml提取液分次將研 缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4C冰箱中。（2）4C下提取4h，1 000g離心15min（實驗中離心機型號LDZ5-2，約4 000rpm）,取上清液。 沉淀中加1ml提取液，攪勻，置4C下再提取小，離心，合并上清液并記錄體積，殘渣棄去。（3）上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇（1ml）平衡柱一上樣一收集樣品一移開 樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱一 100%乙醚（5ml）洗柱一 100%甲醇

6、（5ml）洗柱一循環(huán)。（4）將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入5ml塑料離心管中，真空濃縮干燥或用氮氣吹干，除去提取液中的甲醇， 用樣品稀釋液定容（一般1g鮮重用1.5ml左右樣品稀釋液定容）。樣品測定（1）包被：在10ml包被緩沖液中加入一定量的包被抗原（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標簽），混勻， 在酶標板每小孔中加100M l。然后將酶標板放入內(nèi)鋪濕紗布的帶蓋瓷盤內(nèi)，置于37C下3h。（2） 洗板：將包被好的板取出，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液，將下口瓶內(nèi)的洗滌液通過乳 膠管均勻加入板上，使每孔充滿洗滌液，放置約0.5min，再甩掉洗滌液。重復3次，將板內(nèi)殘留洗 滌液在吸水紙上甩干。（3）競爭：即加標準物、待測

7、樣和抗體。加標樣及待測樣：取樣品稀釋液0.98ml，內(nèi)加20p l激素的標樣試劑（100p g/ml），即為 2000ng/ml 標準液，然后再依次稀釋 1000ng/ml, 500ng/ml,250/ng/ml,125ng/ml，0ng/ml。將系列 標準樣加入96孔酶標板的前三行，每個濃度加3孑L，每孔50p l,其余孔加待測樣，每個樣品重復 三孔，每孔50p l。加抗體：在5ml樣品稀釋液中加入一定量的抗體（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標簽），混勻后每孔加 50p l，然后將酶標板加入濕盒內(nèi)開始競爭。競爭條件37C左右0.5h。（GA4為37C、17分鐘）（4） 洗板：方法同包被之后的洗板。但要

8、注意以下兩點：加洗滌液時一定要從標準曲線的低濃 度一邊向高濃度一邊加，并且酶標板要向高濃度的一邊傾斜。第一次加入洗滌液后要立即甩掉。 然后再接著加第二次。注意這兩點的目的是防止各孔的交叉反應。（5）加二抗：將一定量的酶標羊抗兔抗體，加入10ml樣品稀釋液中（最適稀釋倍數(shù)見試劑盒標 簽），混勻后，在酶標板每孔加100p l，然后將其放入濕盒內(nèi)，置37C下，溫育0.5h。（6） 洗板：方法同競爭之后的洗板（步驟4），洗五次，（7） 加底物顯色：稱取10-20mg鄰苯二胺（OPD）溶于10ml底物緩沖液中（小心勿用手接觸OPD）， 完全溶解后加24p l 30% H202。混勻，在每孔中加100p

9、l （在暗處操作），然后放入濕盒內(nèi)，當顯 色適當后（即0ng/ml孔與2000ng/ml孔的OD差值為1.0左右時），每孔加入50p l 2mol/L硫酸終 止反應。（8）比色：用2000ng/ml濃度孔（即標準曲線最高濃度孔）調(diào)0，在酶聯(lián)免疫分光光度計上依次 測定標準物各濃度和各樣品490nm處的OD值。結(jié)果計算與分析用于ELISA結(jié)果計算最方便的是logit曲線。曲線的橫坐標用激素標樣各濃度（ng/ml）的自 然對數(shù)表示，縱坐標用各濃度顯色值的logit值表示。Logit值的計算方法如下：B/B0BLogit（B/B。）=ln =ln01-B/B0B0-B其中Bo是0ng/ml孔的顯色值，

10、B是其它濃度的顯色值。作出的logit曲線在檢測范圍內(nèi)應是直線。待測樣品可根據(jù)其顯色值的logit值從圖上查出其 所含激素濃度（ng/ml）的自然對數(shù)，再經(jīng)過反對數(shù)即可知其激素的濃度（ng/ml）。另外，也可用激素標樣各濃度（ng/ml）的自然對數(shù)與各濃度顯色值的logit值的回歸方程代替 logit曲線，求得樣品激素的濃度。一般來說，二種方法求得的結(jié)果會略有差異。求得樣品中激素的濃度后，樣品中激素的含量（ng/g-fw）可用下式計算：N-V2-V3-BA =- V -W1其中，A表示激素的含量（ng/gfw）；V2表示提取樣品后，上清液的總體積；V1表示進行真空濃縮干燥的上清液體積；（當提取

11、的上清液全部進行真空濃縮干燥時V1與V2的體積是相等的）V3表示真空濃縮后用樣品稀釋液定容的體積；W表示樣品的鮮重；N表示樣品中激素的濃度（ng/ml）；B表示樣品的稀釋倍數(shù)（樣品稀釋液定容以后的稀釋倍數(shù)）。注意事項激素提取液中是否存在干擾物質(zhì)的判斷和去除通常用以下幾個質(zhì)量控制試驗來判斷提取液中是否存在干擾物質(zhì)：稀釋試驗，即將樣品提取 液做一系列稀釋，進行ELISA測定，所獲得的劑量反應曲線應與標準曲線平行，或者說測定值與稀 釋倍數(shù)相對應，例如做10倍稀釋，則測定值應是原值的1/10，若差異太大，表明有干擾物存在。 平行試驗，即將樣品提取液定量加入系列濃度的標準物之中，進行ELISA測定，所得

12、出的標準曲 線應與不加樣品液的標準曲線平行，否則可以斷定有干擾物存在。回收率試驗，將樣品分為完全 等量的兩份，一份加入已知量的標準激素，另一份做對照，進行提取測定，兩個測定值之差與加入 值之比即為回收率，若回收率過低或者超過100%，也說明有干擾物存在。儀器法校正試驗，ELISA 測定的樣品量極微，而且樣品純度要求比儀器法要低得多，因而用通常的氣譜或液譜法難以對ELISA 作出校正，目前用高分辨率的氣質(zhì)聯(lián)機可以對ELISA作出校正，目前用高分辨率的氣質(zhì)聯(lián)機可以對 ELISA測定作出適當?shù)脑u價。樣品中存在的干擾物質(zhì)有色素、酚類物質(zhì)等。酚類物質(zhì)可用可溶性與不可溶性PVP （聚乙烯毗 咯烷酮）除去，可溶性PVP可直接溶于樣品提取液中，不溶性PVP可在研磨時加入。一般材料在加 入0-100mgPVP/gFW即可達理想效果。葉綠素等色素可通過將激素提取液過C18預處理小柱去除。2為得到較好效果，操作一定要認真，注意：（1）在整個ELISA操作過程中，每次加樣盡可能 一致，速度要快。（2）若同時做二塊以上的板，應將洗好的板放在4C下，依次拿出加樣。（3）加 樣的環(huán)境溫度不宜過高。（4）不使用邊緣孔時，每次加樣后，也應在邊緣孔內(nèi)加入相應的溶液。（5） 在正式樣品測定之前，先通過預備試驗找到包被抗原、抗體、二抗的最適稀釋倍數(shù)及標準物的最