KGF-2基因克隆及在大腸桿菌中的表達教學文案

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。KGF-2基因克隆及在大腸桿菌中的表達KGF-2基因克隆及在大腸桿菌中的表達1引言角質(zhì)形成細胞生長因子-2(KeratinocyteGrowthFactor-2，KGF-2)，又稱為成纖維細胞生長因子-10(FibroblastGrowthFactor-10，F(xiàn)GF-10)，是FGFs超家族中角質(zhì)細胞生長因子家族的一員。1.1KGF-2的來源和基因結(jié)構(gòu)KGF-2主要是由成纖維細胞及其他間充質(zhì)來源的細胞分泌，如成纖維細胞、損傷修復(fù)中的肉芽組織以及上皮組織周圍的T細胞均可分泌KGF-2。此外，上皮組織的損傷

2、還可上調(diào)KGF-2的表達。人kgf-2基因位于染色體的5p12-p13區(qū)域，其基因為單拷貝，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。1997年，Emoto等1克隆了人的kgf-2的cDNA，其編碼的蛋白質(zhì)由208個氨基酸組成，N端有39個氨基酸組成的疏水信號肽，成熟蛋白含169個氨基酸，其中4個半胱氨酸形成2對二硫鍵，另一個折疊在肽中。理論相對分子質(zhì)量為19.3KD，對肝素具有較強的親和作用。Kgf-2的立體結(jié)構(gòu)與其它FGF家族成員相似，為三葉草型。1.2KGF-2的功能KGF-2通過與上皮細胞細胞膜上受體作用特異性促進上皮細胞的增殖、分化和遷移，是胚胎器官發(fā)育中重要的多功能信號分子。KGF-2能夠通過

3、刺激表皮細胞的增殖、遷移和分化直接促進傷口的愈合，在組織的重塑過程中起趨化作用2。KGF-2通過與損傷位點黏膜的表皮細胞上的受體結(jié)合，引起細胞向受傷處遷移，保護角質(zhì)細胞免受ROS誘導的細胞凋亡，由此來加快傷口的愈合。此外，KGF-2同時也能通過刺激其它在組織修復(fù)和再生過程中有著非常重要作用的細胞因子(如血小板衍生生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子和成纖維細胞生長因子)的表達來間接作用于組織的重塑3。KGF-2有兩種細胞膜表面受體：FGFR1b和FGFR2b。KGF-2與FGFR2b的親和力高，是其特異性配體。KGF-2與受體結(jié)合后，促使受體處于細胞內(nèi)的端酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體具有酪氨酸蛋白激酶活性

4、，并與一系列靶蛋白發(fā)生作用，引發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮生物學功能4,5。在脊椎動物器官形態(tài)發(fā)生過程中，KGF-2在間充質(zhì)-上皮相互作用中十分關(guān)鍵，如在四肢形成過程中，KGF-2在側(cè)板中胚層的有限區(qū)域表達，它誘導尖外胚層嵴細胞的分化，刺激細胞增殖導致肢芽形成6。脊椎動物器官的分支狀形態(tài)發(fā)生也與FGFs家族相關(guān)，研究表明在小鼠肺的發(fā)育過程中，KGF-2可能是一個十分關(guān)鍵的生長因子和趨化物質(zhì)7。其它經(jīng)歷分支狀發(fā)生的器官，像淚腺和胰腺，KGF-2在其發(fā)育過程中也發(fā)揮一定作用8,9。另外，KGF-2幾乎參與顱面區(qū)所有的結(jié)構(gòu)發(fā)育，無論是早期的形成過程，還是后期的生長調(diào)節(jié)，KGF-2/KGFR2b信號通路都是十

5、分關(guān)鍵的10。在生殖系統(tǒng)的發(fā)育過程中，KGF-2也起著重要的作用。在前列腺的發(fā)育過程中，間充質(zhì)通過分泌KGF-2等細胞因子來誘導前列腺上皮細胞發(fā)育。Donjacour等研究FGF-10雄性小鼠模型時發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)這種小鼠出生時雄性第二性器官缺失或萎縮，包括前列腺、精囊、尿道球腺和尾部輸精管9。另外，Yucel等利用基因敲除小鼠模型證實，KGF-2等生長因子在生殖結(jié)節(jié)的正常發(fā)育過程中協(xié)同其他細胞因子起著非常重要的作用10。這些研究結(jié)果說明KGF-2可能在前列腺和其他附屬性器官發(fā)育中起十分重要的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGF-2在脊椎動物四肢、牙齒和毛發(fā)（羽毛），以及肺、耳、盲腸、頜下腺、胰腺和前列腺等器

6、官的形成過程中起著極為重要的作用11。KGF-2也有輻射防護作用12。KGF-2可以提高輻射后小鼠的腸干細胞的存活率，并對輻射引起的氣道上皮細胞的通透性升高具有拮抗作用。Knan等人應(yīng)用離子微集落刺激法發(fā)現(xiàn)，KGF能顯著降低輻射引起的腸道損傷。Waters和Savla等人用測定熒光素異硫氰酸鹽標記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的外滲來反應(yīng)培養(yǎng)的Calu-3和16HBE140單層細胞的通透性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同等劑量的輻照條件，KGF（50ng/ml）預(yù)處理的培養(yǎng)單層細胞對FITC-BSA的通透性明顯下降，而KGF對未輻射過的單層細胞的通透性無影響。通過激活蛋白激酶C（PKC），KGF可以加速輻射

7、誘導的DNA損傷修復(fù)，并維持細胞骨架蛋白F-肌纖蛋白的穩(wěn)定和保護細胞間連接。1.3Kgf-2在大腸桿菌中的表達優(yōu)勢近年來的研究發(fā)現(xiàn)kgf-2基因在畢赤酵母中表達時，目的產(chǎn)物容易遭受宿主蛋白酶的降解13。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有容易操作、能高效表達的特點，而且就重組蛋白的生物學活性而言，兩種方式表達的重組蛋白均具有類似天然蛋白的生物學功能，其刺激NIH/3T3細胞增殖能力也幾乎相當。因此本研究希望利用大腸桿菌表達系統(tǒng)來實現(xiàn)該基因的高效穩(wěn)定表達。2主要儀器及原料2.1材料2.1.1菌株來源BL21菌株由HYPERLINK/kns50/Navi/Bridge.aspx?DBCode=cjfd&LinkT

8、ype=BaseLink&Field=BaseID&TableName=CJFDBASEINFO&NaviLink=%e5%86%9b%e4%ba%8b%e5%8c%bb%e5%ad%a6%e7%a7%91%e5%ad%a6%e9%99%a2%e9%99%a2%e5%88%8a&Value=JSYXt_blank軍事醫(yī)學科學院饋贈2.1.2寡核苷酸引物實驗所需引物由上海生工公司合成pet28kgf(+)：CGGAATTCGGTCAAGACATGGTGTCACCpet28kgf(-)：CGCTCGAGTTATGAGTGTACCACCATTGGA2.1.3試劑PCR反應(yīng)體系：dNTP溶液，Taq酶

9、，Xho，Mg2+溶液DNA電泳體系：瓊脂糖，Marker，6loadingBuffer，TAE緩沖液，Goldview蛋白電泳體系：10%過硫酸銨，TEMED，巰基乙醇，30%膠母液，分離膠緩沖液（pH8.8），濃縮膠緩沖液（pH6.8），10電極緩沖液（pH8.3），2上樣緩沖液，染色液，脫色液試劑盒：質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基溶液：60mmol/L氯化鈣溶液抗生素：卡那霉素，氨芐青霉素2.2實驗儀器PCR儀：Eppendorf公司DNA電泳儀：北京六一蛋白電泳儀：北京六一低溫離心機：美國Beckman公司搖床：ZHWY2008B制冰機：SI

10、M-F124（SANYO）恒溫水浴鍋：GFL1002超低溫-20冰箱：MDF-U5410（SANYO）4冰箱：BCD-257SLB漩渦混勻器：VORTEX-GENIE2超凈工作臺：HD-1360新型格蘭仕WD750ASL23微波爐電轉(zhuǎn)化儀3實驗方法14,153.1質(zhì)粒DNA的提取分別取BL21（pET28a）和BL21（pET22bkgf-2）菌液接種于5ml(含氨芐青霉素和卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜，各自用試劑盒法提取質(zhì)粒DNA，步驟如下：（1）將5ml菌液13000rpm離心30s，收集沉淀。（2）倒掉上清，將沉淀完全懸浮于100l懸浮液（溶液）中。（3）加入150l裂解液

11、（溶液）輕柔地顛倒混勻10次左右，溶液逐漸變得粘稠清亮。（4）加入150l中和液（溶液），輕柔地顛倒混勻10次左右。（5）13000rpm離心8-10分鐘左右，將上清液小心轉(zhuǎn)移入一個新的1.5ml離心管中，加入等體積的（約400l）結(jié)合液，顛倒混勻。（6）將混合液吸入離心純化柱中，靜置至少3分鐘，13000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液。（7）將純化柱重新套入廢液收集管中，加入600l80%的異丙醇，13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。（8）取出純化柱，將其套入一個干凈的1.5ml離心管，開蓋放置2-3分鐘，加入50l雙蒸水于硅膠膜上，不能粘在管壁上，室溫下放置5分鐘后，13

12、000rpm離心1分鐘。（9）將洗脫液重新吸入純化柱中，再洗脫一次，這樣可獲得較高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。（10）離心管中收集的液體即是洗脫下來的質(zhì)粒DNA。模板pET22b重組子質(zhì)粒電泳確認后準備進行PCR，pET28a質(zhì)粒電泳確認后4保存準備酶切。3.2PCR擴增目標基因（1）取一個PCR管，在其中按順序添加以下各成分反應(yīng)液反應(yīng)液：正鏈引物pet28kgf(+)1l負鏈引物pet28kgf(-)1ldNTP1lBuffer5l模板pET22b重組子1l雙蒸水40lTaq酶1l總體積50l（2）稍作離心。（3）將反應(yīng)管放入PCR儀中，按下列條件設(shè)計好程序，進行PCR反應(yīng)。（4）反應(yīng)程序：94條件下

13、模板DNA預(yù)變性5分鐘變性9430s退火5230s延伸722min30個循環(huán)后，72條件下延伸10min補平單鏈。（5）PCR反應(yīng)結(jié)束后取2l反應(yīng)液用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，鑒定PCR產(chǎn)物是否存在以及大小。（6）電泳確認后，余下的PCR產(chǎn)物用試劑盒法進行純化。3.3酶切APCR產(chǎn)物酶切體系ddH2O33lPCR回收產(chǎn)物10lEcoR1lXho1lXho緩沖液5l定容50lBpET28a酶切體系第一次酶切：ddH2O34lpET28a10lEcoR1lEcoR緩沖液5l定容50l酶切產(chǎn)物經(jīng)回收后，進行第二次酶切第二次酶切：ddH2O34lpET28a10lXho1lXho緩沖液5l定容50l

14、（1）用手指輕彈管壁使溶液混勻，用離心機甩一下，使溶液集中在管底。（2）混勻反應(yīng)體系后，將Eppendorf管插于泡沫塑料板上，37水浴下反應(yīng)6-8小時。（3）酶切完全后用試劑盒法純化產(chǎn)物。（4）取2l純化后產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，確認酶切是否完全。3.4連接（1）在一1.5mlEppendorf管中加入2l酶切后的載體pET28a和6l酶切后的PCR產(chǎn)物片斷。（2）添加1l的10DNA緩沖液以及1l的DNA連接酶。即PCR產(chǎn)物6lpET28a2l10連接緩沖液1lT4連接酶1l總體積10l（3）混勻后用離心機將液體全部甩到管底。（4）16條件下保溫過夜。（5）利用宿主的感受態(tài)細胞進行

15、轉(zhuǎn)化實驗。3.5轉(zhuǎn)化3.5.1細菌感受態(tài)的制備（1）取5l的BL21菌種接種于5ml的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。（2）取100l培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于5ml的LB液體培養(yǎng)基中37振蕩培養(yǎng)2-2.5小時左右，使A600達0.4左右。（3）將培養(yǎng)液1.5ml移至Eppendorf管中，冰浴20分鐘，使其停止生長。（4）4條件下，3000r/min離心5分鐘，棄取上清液。（5）添加0.75ml預(yù)冷的60mmol/L氯化鈣溶液，用槍輕輕吹打。（6）冰浴20-30分鐘后，4條件下，3000r/min離心5分鐘，盡可能棄取上清液。（7）細胞沉淀用100l預(yù)冷的60mmol/L氯化鈣溶液懸浮，冰浴放置，備用。3

16、.5.2轉(zhuǎn)化（1）將電擊杯放在冰上預(yù)冷，凍存的感受態(tài)細胞取出冰上融解。（2）各取100l的感受態(tài)細胞分別加入1l連接液和1l酶切后的空載體，小心混勻，冰浴上放置20分鐘。（3）將混合液加入預(yù)冷的電擊杯中，注意擦干杯外的水，防止電火花，放入電轉(zhuǎn)化儀的反應(yīng)槽內(nèi)接上電源。（4）2.5千伏，200歐，電容25微法拉，電擊。（5）聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入LB液體培養(yǎng)基，將混合液洗出，分別轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。（6）37復(fù)蘇培養(yǎng)1小時，使其充分表達抗性。（7）取適量涂平板，將平板倒置在培養(yǎng)箱中，37培養(yǎng)16-24小時。3.6菌落PCR（1）轉(zhuǎn)化后的實驗組細胞在含有卡那抗生素的LB平板上會長出

17、許多白色抗性菌落，對照組也長出少量的白色菌落。分別取實驗組和對照組的2個白色菌落接種于含有卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基37培養(yǎng)16-24小時。（2）分別取實驗組和對照組2l的培養(yǎng)液于PCR管中，95變性10分鐘。（3）再分別在其中按順序添加以下各成分反應(yīng)液反應(yīng)液：正鏈引物pet28kgf(+)1l負鏈引物pet28kgf(-)1lDNTP1lBuffer5l雙蒸水39lTaq酶1l總體積50l（4）按程序進行反應(yīng)，程序同3.2。（5）PCR反應(yīng)結(jié)束后取2l反應(yīng)液用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果。3.7IPTG誘導kgf-2表達（1）選取陽性鑒定結(jié)果的2個菌落接種于5ml含卡那霉素的LB培

18、養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。（2）分別取50l培養(yǎng)液于5ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時左右，至A600達0.5左右。（3）取出1.0ml樣品作為IPTG誘導前的樣品，-20保存。（4）其余樣品中添加5l的IPTG在37振蕩培養(yǎng)4小時。（5）將誘導前樣品與誘導后樣品5000r/min離心5min。分別回收菌體沉淀。（6）沉淀樣品中分別加入雙蒸水懸浮細菌，洗滌后5000r/min離心5min，回收菌體。（7）菌體沉淀中加入25l的PBS緩沖液和25l的2SDS上樣緩沖液，在漩渦混合器上劇烈振蕩1min，使菌體完全溶菌。（8）將樣品分別在沸水浴中保持5min，立即放入冰浴中冷卻。

19、（9）將誘導前樣品與誘導后樣品保存在-20，準備進行SDS電泳。3.8SDS電泳3.8.1電泳膠的準備（1）制膠板的安裝（短玻璃面朝內(nèi)），要求密封，以免膠液泄漏。（2）配制15%的分離膠。雙蒸水2.75ml30%膠母液3.75ml分離膠緩沖液0.9ml10%SDS75l10%APS60lTEMED5l（3）將配制好的分離膠加入制膠槽中，注意應(yīng)隨著邊緣緩慢加入，千萬別進氣泡。凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm處。（4）輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層雙蒸水封膠，使凝膠表面變得平整，靜放30分鐘到一個小時，使凝膠聚合。凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現(xiàn)一個清晰的界面，可以微微

20、傾斜模具，檢測凝膠是否聚合。（5）除去上面的水層，再用濾紙吸盡殘留的液體。（6）配制5%的濃縮膠30%膠母液0.5ml濃縮膠緩沖液0.37ml雙蒸水2.1ml10%SDS25l10%APS25lTEMED5l（7）迅速將配制好的濃縮膠加到分離膠上面，并將梳子插入凝膠內(nèi)，至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊，小心避免混入氣泡。將凝膠垂直放置于室溫下，約30min凝膠聚合。（8）凝膠聚合后，即進行電泳。3.8.2電泳（1）將膠板放入電泳槽中，在上下電泳槽中加入1電極緩沖液，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。輕輕拔出梳子，注意不要將加樣孔撕破。（2）在電泳槽的泳道中分別添加20l標準蛋白質(zhì)與樣品。標準

21、蛋白質(zhì)和樣品在加樣前應(yīng)離心1s，以除去蛋白碎片。加樣時用微量移液器將樣品加入樣品孔的底部，避免帶入氣泡。（3）接通電源，上槽接負極，下槽接正極，起始電壓80伏，待溴酚蘭前沿進入分離膠，電壓為120伏。（4）電泳大致需要1-3小時。待溴酚蘭前沿到達電泳槽底部時，切斷電源，從電極上拔掉電極插頭，取出玻璃板。3.8.3染色與脫色（1）電泳結(jié)束后，帶上手套，從電泳槽中取出凝膠板，小心移去兩玻璃板之間的隔片，利用專用的鏟子輕輕撬開玻璃板，小心從制膠板上將凝膠剝下，棄去濃縮膠。在右下角切去小片作為定位標記。（2）用清水洗膠，將分離膠放入染色液中，置于50溫水浴中，染色30分鐘，小心不要將膠撕破。（3）從染

22、色液中將膠取出用水漂洗后，將膠放入脫色液中進行脫色，直到背景藍色褪淡，見到條帶，根據(jù)具體情況，大約換3-4次脫色液即可。4結(jié)果與分析4.1pET28a質(zhì)粒提取電泳結(jié)果用試劑盒法從大腸桿菌中提取pET28a質(zhì)粒的電泳結(jié)果如圖1所示，pET28a質(zhì)粒的大小約為6000bp，電泳泳動速率較慢，離點樣孔較近，且由于質(zhì)?？截悢?shù)較低和提取過程中振蕩較劇烈使質(zhì)粒產(chǎn)量偏低，電泳結(jié)果比較模糊。543214500bp1200bp圖1pET28a的電泳圖1孔道為DNAMarker2，3，4，5孔道為提取的質(zhì)粒4.2PCR產(chǎn)物回收結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測存在后，用試劑盒法進行純化的電泳結(jié)果如圖2所示，大小為600bp

23、左右，與理論目標片段相同且濃度增加，電泳條帶非常清楚。3211200bp500bp圖2PCR產(chǎn)物回收電泳圖1孔道為DNAMarker2，3孔道為純化的PCR產(chǎn)物4.3轉(zhuǎn)化結(jié)果和鑒定連接好的載體和酶切后的空載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在含有卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)的結(jié)果如圖3所示，由于載體酶切后成線性不易轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所以對照組的菌落數(shù)很少或幾乎沒有，而實驗組載體與目的基因連接成環(huán)狀易于轉(zhuǎn)化，菌落數(shù)為對照組的幾倍。對照組實驗組圖3轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生長情況4.4菌落PCR鑒定結(jié)果挑取的陽性菌落裂解并經(jīng)PCR擴增后的電泳結(jié)果如圖4所示，在600bp左右有明顯的條帶，對照組在此處無明顯條帶。這說明

24、轉(zhuǎn)化結(jié)果是成功的，可以進行下一步的蛋白分離和鑒定實驗。但可能由于裂解菌落時間不夠充分，或者電泳的分辨率較低，細菌基因組的條帶卻沒能夠顯示。12345674500bp2000bp1200bp500bp圖4菌落PCR鑒定結(jié)果1孔道為DNAMarker2孔道為對照組的PCR產(chǎn)物3，4，5，6，7孔道為實驗組的PCR產(chǎn)物4.5Kgf-2的表達結(jié)果轉(zhuǎn)化后的菌落挑取陽性克隆子經(jīng)培養(yǎng)后，對其進行IPTG誘導，SDS的電泳結(jié)果如圖5所示：實驗組在35-25KD之間明顯有多余的一條帶，從分子量上來看比kgf-2的理論值24KD要大一些?？赡苡捎谀康幕蛉诤媳磉_了載體上的一部分基因所致。可以說IPTG的誘導表達是

25、成功的。12345611645.035.025.018.414.4圖5目標蛋白電泳圖1孔道為蛋白Marker2，3孔道為對照組4，5，6孔道為實驗組5討論5.1轉(zhuǎn)化注意事項轉(zhuǎn)化效率的高低和感受態(tài)宿主細胞的制備有著很大的關(guān)系。只有經(jīng)過特殊處理的培養(yǎng)細胞才能接受外源DNA，且整個轉(zhuǎn)化過程都應(yīng)該無菌操作，嚴防雜菌污染。并且轉(zhuǎn)化效率與外源DNA濃度之間在一定范圍內(nèi)成正比，所以在轉(zhuǎn)化之前先要測定載體和外源DNA的濃度以使兩者的比例適中。但外源DNA的量過多轉(zhuǎn)化效率反而會降低。一般，質(zhì)粒DNA的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的十分之一。5.2SDS注意事項在配制膠的過程中，一定要注意安全，兩種丙烯酰胺單體及溶

26、液都有毒性，操作時要戴手套。整個過程的關(guān)鍵是分離膠和濃縮膠能否凝固，對其影響最大的就是10%的APS，它應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，不能保存過長時間，否則膠不易凝固。在用考馬斯亮蘭染色時可以在50左右的水浴中進行，這樣在較短的時間內(nèi)就可以達到預(yù)期的效果，脫色時也可以過夜。5.3表達結(jié)果的討論本實驗kgf-2基因的表達量低，經(jīng)SDS電泳檢測結(jié)果不是很明顯。這可能由于實驗所采用的kgf-2基因是經(jīng)重組后的突變體，且經(jīng)基因序列分析kgf-2基因發(fā)現(xiàn)其中含有15個大腸桿菌稀有密碼子，包括編碼7個精氨酸、1個亮氨酸和7個甘氨酸的密碼子，其中有2個精氨酸稀有密碼子和1個甘氨酸稀有密碼子是連續(xù)出現(xiàn)的。在這種情況下，在大腸

27、桿菌BL21中表達時可能會存在障礙，因此表達的蛋白可能達不到理想的結(jié)果16。6創(chuàng)新之處由于kgf-2本身的特殊性，在真核生物如酵母菌中表達容易被蛋白酶降解，因此目的基因的表達量受到嚴重影響。本課題以大腸桿菌為宿主菌，研究目的基因在其中的表達狀況，以尋找更適用于kgf-2基因的表達系統(tǒng)。7待討論問題由于kgf-2基因中含有15個大腸桿菌稀有密碼子，因此用普通的大腸桿菌表達會有限制。Rosetta（DE3）宿主菌是從BL21衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補充密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。采用Rosett

28、a菌株避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制，也可以對表達的蛋白進行后續(xù)的生物活性鑒定。但大腸桿菌表達該基因時表達水平較低，要找到高效穩(wěn)定的表達菌株還需要進一步的研究。參考文獻1EmotoH,agashiraS,atteMG,al.StructureandExpressionofHumanFibroblastGrowthFactor-10J.JBiolChem,1997,272(37):23191-4.2王虎根,程敏,葉小弟,諸葛定娟,鄭高利.重組人角質(zhì)細胞生長因子-涂膜劑促進大鼠皮膚傷口愈合J.國現(xiàn)代應(yīng)用藥學,2005,(04):284-288.3PirvolaU,BradleySD,L

29、iangXQ,etal.FGF/FGFR-2(b)signalingisessentialforinnerearmorphogenesisJ.JNeurosci,2000,20(16):6125-34.4王金鳳,徐東剛,彭善云,蔡欣,鄒民吉,王嘉璽.HYPERLINK/kns50/detail.aspx?dbname=CJFD2004&filename=JSYX200401008&filetitle=%e9%87%8d%e7%bb%84%e4%ba%ba%e8%a7%92%e8%b4%a8%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%94%9f%e9%95%bf%e5%9b%a0%e5%ad%9

30、0-2%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e7%9a%84%e5%85%8b%e9%9a%86%e5%92%8c%e8%a1%a8%e8%be%beo重組人角質(zhì)細胞生長因子-2基因的克隆和表達相似度39%t_blank重組人角質(zhì)細胞生長因子-2基因的克隆和表達J.HYPERLINK/kns50/Navi/Bridge.aspx?DBCode=cjfd&LinkType=BaseLink&Field=BaseID&TableName=CJFDBASEINFO&NaviLink=%e5%86%9b%e4%ba%8b%e5%8c%bb%e5%ad%a6%e7%a7%91%e5%ad%a6%e9%9

31、9%a2%e9%99%a2%e5%88%8a&Value=JSYXt_blank軍事醫(yī)學科學院院刊,HYPERLINK/kns50/Navi/Bridge.aspx?DBCode=cjfd&LinkType=IssueLink&Field=BaseID*year*issue&TableName=CJFDYEARINFO&Value=JSYX*2004*01&NaviLink=%e5%86%9b%e4%ba%8b%e5%8c%bb%e5%ad%a6%e7%a7%91%e5%ad%a6%e9%99%a2%e9%99%a2%e5%88%8at_blank2004,(01):25-27.5Martin,G.Makingavertebratelimb:newplayersenterfromthewingsJ.Bioessays,2001,23(10):8658.6王艷春,張兆山.角質(zhì)形成細胞生長因子-2的應(yīng)用研究進展J.生物技術(shù)通訊,2005,(04):432-434.7GovindarajanV,ItoM,MakarenkovaH.P,etal.EndogenousandectopicglandinductionbyFGF-10J.DevBiol,2000,225(1):188200.8BhushanA.,ItohN,KatoS,etal.Fg