肌苷育種 Microsoft Word 文檔(共71頁)

1、天津科技(kj)大學(xué)碩士學(xué)位論史摘要(zhiyo)本文以代謝控制(kngzh)發(fā)酵理論為指導(dǎo)，重點(diǎn)研究了肌苷高產(chǎn)菌的選育及其發(fā)酵條件。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：1建立了發(fā)酵液中肌苷定量測(cè)定的方法離子交換法，對(duì)其最佳分離條件進(jìn)行了研究，并與紙層析法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該方法準(zhǔn)確度和精確度比紙層析方法高，可用于簡(jiǎn)單條件下對(duì)肌苷發(fā)酵液中目的產(chǎn)物的測(cè)定。2以枯草芽孢桿菌TY一21為出發(fā)菌株，通過硫酸二乙酯(DES)誘變定向選育出一株肌苷產(chǎn)生菌TX一3，其遺傳標(biāo)記為腺嘌呤缺陷、硫胺素缺陷、8氮鳥嘌呤抗性和磺胺胍抗性(Ade。+TH+8AG。+SG。)。在未經(jīng)優(yōu)化的搖瓶發(fā)酵條件下可產(chǎn)肌苷1241dL。3研究了枯草

2、芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX一3搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的最佳條件。通過均勻設(shè)計(jì)和模式識(shí)別方法分別研究了肌苷種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比。在最佳條件下，搖瓶分批發(fā)酵產(chǎn)量為1894L。同時(shí)采用流加方式研究了搖瓶補(bǔ)料分批發(fā)酵條件，該條件下肌苷產(chǎn)量可達(dá)到2479L。4利用5 L罐分批發(fā)酵數(shù)據(jù)，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行了代謝流分析?；谖锪髌胶庠?，初步進(jìn)行了發(fā)酵過程的代謝流分析；結(jié)合發(fā)酵過程曲線分析了肌苷發(fā)酵全程代謝行為；應(yīng)用TX一3菌株的代謝流量平衡模型計(jì)算出了肌苷發(fā)酵中后期的代謝流分布并通過MATLAB軟件線性規(guī)劃得到理想代謝流分布，結(jié)果表明盡量降低EMP途徑的代謝通量有利于肌苷的合成，提高肌

3、苷合成途徑中各關(guān)鍵酶的活力可有效增加肌昔的生成量，減少副產(chǎn)物的生成和提高發(fā)酵過程溶氧水平均可增加肌苷合成代謝流。關(guān)鍵詞：肌苷，枯草芽孢桿菌，誘變育種，發(fā)酵，代謝流分析天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractAccording to the theory of metabolic control fermentation，the dissertationfocuses on the breeding and fermentation condition of inosine producing strainThe main research contents and results are as

4、 follows：(1)The method of ion exchange chromatography was defined to determinateinosine concentration quantitatively in the fermentation brothThe separationconditions of this method was optimized and compared with paperchromatography methodBoth accuracy and precision are better than that of paperchr

5、omatography(2)One inosine highproducing strain TX一3(Ade一+Thi+8一AG+SG)wasderived from Bacillus subtilis TY-21 with DES treatment，which could produceinosine 1241 gL under the fermentation condition without being optimized(3)The batch fermentation condition of strain TX一3 in shake flask was studiedin t

6、his dissertationThe proportions of seed medium and fermentation mediumwere optimized by pattern recognition and uniform design experimentThe seedculture conditions and fermentation conditions were also studiedUnder theoptimum condition，strain TX-3 could produce inosine 18949L by shaking flaskbatch f

7、ermentationMeanwhile the fed batch fermentation conditions were studiedThe production of inosine under optimized fed batch fermentation was 24799L(4)The metabolic flux analysis was applied in inosine fermentation processbased on the experimental data from batch fermentation in 5-liter fermentorBased

8、on the flux balance principle，the metabolic flux analysis method of inosine batchfermentation was definedThe whole metabolic process of inosine was analysedcombined with fermentation process curveUsing metabolic flux balance model ofinosine synthesis by Bacillus subtilis model，the metabolic flux dis

9、tributionsduring the middle and last period were determination and the optimal fluxdistributions were calculated by linear program of MATLAB softwareThe fluxanalysis indicated that reducing the metabolic flux of EMP pathway were useful tOlie synthesis；Increasing activities of key enzymes in inosine

10、biosynthesis pathwaywould increase inosine productionReducing byproduct synthesis were importantfor inosine high producing，as well as the heightening soluble oxygen levelKeywords：Inosine，Bacillus subtili，mutagenic breeding，fermentationmetablic flux analysis天津(tin jn)科技大學(xué)碩士學(xué)位論文1前言(qin yn)11肌苷的理他性質(zhì)(xn

11、gzh)肌苷(1nosine，縮寫IR)又稱次黃嘌呤核苷，是次黃嘌呤和核糖的縮合物，其磷酸酯為肌苷酸。次黃嘌呤核苷中，在次黃嘌呤堿基N-9的位置上，以糖苷鍵的形式聯(lián)結(jié)了以呋喃形式存在的核糖的第一位碳原子。肌苷分子式為C1。H12N405，相對(duì)分子質(zhì)量26823，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：oH肌苷為白色結(jié)晶或呈無水粉末狀，易溶于水，口H近中性。在飽11水溶液中約含肌苷15盛，L。在稀鹽酸或氫葷眥鈉溶液中易溶，在氯仿、乙醇中不溶。無臭，昧微苦。熔點(diǎn)為218。C“。肌營在水中存在三種晶體形式：(1) 兩個(gè)結(jié)晶水的晶體(常見的肌苷)(2)a型(斜方晶)無水晶體(3)a型(單斜晶)無水晶體 常溫下(加)，肌昔主要以

12、兩個(gè)結(jié)晶水的晶體形式存在；在較高溫度下，存在兩種無水晶體形式。肌苷分子中的堿基存在酮式和烯醇式互變異構(gòu)現(xiàn)象，所以在堿性條件下烯醇式結(jié)構(gòu)的分子能顯示出弱酸|生，和堿反應(yīng)生成鹽。肌苷鈉容易和水結(jié)合成帶25個(gè)結(jié)晶水的月n苷鈉晶體，在水中溶解度增大。在肌苷工業(yè)生產(chǎn)中，利用肌苷和Hn昔鈉鹽之溶解度不同的性質(zhì)，通過調(diào)整溶液pH值的方法(fngf)，將肌苷從溶液中結(jié)晶分離出來(ch li)。胍苷除了能和堿反應(yīng)生成鹽外，還可和酸反應(yīng)生成鹽，這是由于目n苷分子中堿基上的氰原子和氫離子作用(zuyng)的結(jié)果。在朋著工業(yè)中，將肌苷發(fā)酵液的DH值調(diào)為34，使肌苷變成帶正電荷的離子，然后將該渤盈過陽離子交換樹脂，使肌

13、苷陽離子在樹脂上進(jìn)行交換并吸附，其它不帶正電荷的雜質(zhì)則不被交換吸附，使月n蔚得到分離。肌苷在酸、堿陛溶液中會(huì)發(fā)生降解，在中性溶液中則較穩(wěn)定。因此，為了使肌苷在溶液中穩(wěn)定不分解，可加入含有磷酸鹽的緩沖溶液，加熱并調(diào)口H值為74，至少可保持6個(gè)月之久。利用肌苷該性質(zhì)可較長時(shí)間保存待分析檢測(cè)的肌苷樣品，需要時(shí)再將樣品的pH值調(diào)至測(cè)試所規(guī)定的酸度值進(jìn)行肌菅含量13qN定，以滿足分析工作中的某些需要。在酸眭溶液中，肌苷降f揮的產(chǎn)物為次黃口票呤和D-核糖，該反應(yīng)被認(rèn)為是酸眭催化1，前言水解。在減眭溶液中，肌昔發(fā)生三個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。溫度升高，反應(yīng)速度明顯加快。該三 個(gè)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)及酸幽撇解反應(yīng)在日n著工業(yè)生產(chǎn)過程中

14、都會(huì)發(fā)生，是造成肌苷降解損失的主要原因。因此在肌苷發(fā)酵液調(diào)至酸性后，應(yīng)盡量縮短其停放時(shí)間，以減少酸勝降解損失；在肌苷溶液蒸發(fā)濃縮過程中，工業(yè)E采用提高真空度的方法，以阿氏其蒸發(fā)溫度，同時(shí)盡量縮短蒸發(fā)時(shí)間，使月n苷在堿性溶液中的降解損失減少到黽低值【2】。由于肌苷分子中的堿基含有共軛體系，所以肌苷分子能吸收紫外光。當(dāng)溶液DH值在36時(shí)，肌苷在紫外最大吸收波長為2485nm，最大摩爾吸光系數(shù)為12250；當(dāng)溶液pH值為112時(shí)，最大吸收波長為253nm，最大摩爾吸光系數(shù)為13100；當(dāng)溶液中含2N HCI時(shí)，最大吸收波長為251ran，最大孽爾吸光系數(shù)為109001”。根據(jù)以上吸光特|生，可定性或

15、定量分析檢鋇4肌苷。12肌苷的用途在食品方面，肌營是5 7肌苷酸的前體，而5肌營酸是食品工業(yè)中重要的助鮮劑?？膳c鳥苷酸、谷氨酸鈉以一定比例混合(hnh)制成復(fù)合鮮味劑一一強(qiáng)力味精，對(duì)傳統(tǒng)味精的升級(jí)換代起重要(zhngyo)作用。肌苷可直接(zhji)透過細(xì)胞膜，進(jìn)入體細(xì)胞內(nèi)，使處于低能缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞荻復(fù)正常水平，繼續(xù)進(jìn)行新陳代謝，并能活化丙酮酸氧化酶類，參與人體細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，具有激活細(xì)胞、刺激代謝等良好作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著或持續(xù)下降時(shí)，細(xì)胞功鰣氐下，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)低自罄陜態(tài)，ATP的加入可以解除i新州聶能狀態(tài)。但瑚P不能透過細(xì)胞膜，而日n若對(duì)細(xì)跑有高度的滲透陘，因此，肌苷是唯代替、體

16、增加ATP的藥物。月n營進(jìn)入細(xì)胞后生成丙酮酸，丙酮酸可分解為輔酶A和乳酬”】。肌苷的醫(yī)用價(jià)值較廣泛，主要應(yīng)用于心臟疾病、肝臟病、白血球減少癥、放射陛照射病、貧血病、血吸蟲病、視網(wǎng)膜炎、神經(jīng)萎縮、毛地黃中毒等癥。日月昔還可以制成肌苷二醛、異丙肌苷，對(duì)精巢t皮瘤、麥粒細(xì)胞癌以及某些病毒性疾患都可以起緩解或抵抗作用，還可以制造干擾素的誘導(dǎo)劑。其毒副作用小，安全勤于，也是預(yù)防肝炎、心血管疾病等多種疾患的良好保健藥品。肌苷除作為藥用外，以它為起始原料，可以合成多種抗病毒藥。病毒唑是由肌育衍生出的抗病毒藥，近幾年發(fā)展很怏。無環(huán)鳥苷是第二代新型廣譜抗病毒藥，是我國規(guī)劃重點(diǎn)發(fā)展的抗病毒藥物之一。我國首刨了以肌

17、苷為原料合成無環(huán)鳥苷的工藝路線。從日n營取得次黃嘌呤，然后合成乙酰鳥苷進(jìn)而合成無環(huán)鳥苷。異丙腮若是一個(gè)潛在開發(fā)的肌菅衍生物，它除了具有抗病毒作用外，同時(shí)具有延緩衰老和增強(qiáng)i己憶的作用，也是一種延緩衰老的保健用藥。2，3，雙脫氧肌苷(DDI)是新開發(fā)的以肌苷為前體物的艾滋病治療藥物，在美國已正式上市【叼。13肌苷的測(cè)定方法圈肌苷的分離測(cè)定方法有離子交換法、紙層析法、紙電泳法、薄層色譜法、高壓液天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文相色譜法等方法。這些分離定量方法各有利弊，如高壓液相色譜是一種高效能的方法，時(shí)間短，需樣量少，分析時(shí)間短，但儀器昂貴，難于普及；離子交換、紙層析、紙電泳等分離(fnl)定量方法，靈敏

18、度稍差，時(shí)間長，但歷史悠久，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，只要選擇好適當(dāng)(shdng)的分離條件也可達(dá)到要求，應(yīng)用較廣泛。131離子交換法分離(fnl)測(cè)定肌苷離子交換柱層析是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異而予以分離的技術(shù)。應(yīng)用離子交換層析技術(shù)分離測(cè)定核酸類物質(zhì)，是由科恩等開發(fā)的?，F(xiàn)已作為準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)方法而被廣泛采用。既可以應(yīng)用強(qiáng)堿l生陰離子樹脂以硼酸緩沖液分離發(fā)酵液中的朋昔和次黃嘌呤，也可以應(yīng)用強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂用醋酸或鹽酸淋洗液梯度洗脫分離提純肌苷。132高壓液相色譜法分離測(cè)定肌苷高壓液相色譜的特點(diǎn)是采用長而細(xì)的層析柱，柱內(nèi)填充物的粒度較細(xì)，在 30-lOOkgcm2的高壓下操作，具有分

19、辨力高、分椰惠度點(diǎn)。適用于核酸類物質(zhì)的分離分析，可在幾分鐘到幾十分鐘的短時(shí)間內(nèi)定量分離011匝g的樣品。核苷類物質(zhì)的分離所用吸附劑為薄膜陽離子交換劑，洗脫緩沖液為甲酸銨或磷酸二氫銨溶液。國內(nèi)應(yīng)用I-IPLC方法測(cè)定朋若含量的研究也有重要進(jìn)展，具體方法見文獻(xiàn)w。133酶法分析鍘定肌苷使用酶法分析測(cè)定核酸類物質(zhì)，即使樣品中混雜有異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)類似物之類的物質(zhì)，也能利用酶的底物專性而區(qū)別定量。而目酶法分析還有能夠同時(shí)定量分析多種待測(cè)物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。但是在酶法分析中，有時(shí)需將樣品稀釋幾百倍乃至幾千倍后再j撕亍測(cè)定，其分析結(jié)果受測(cè)定的紫外吸光度變化的微小誤差的影響甚大，故定量和測(cè)定操作需小心進(jìn)行。酶去測(cè)定日n

20、苷使罔核苷磷酸化酶和黃嘌呤氧化酶，由肌昔生成次黃嘌呤，進(jìn)而生成黃嘌呤，最后生成尿酸進(jìn)行測(cè)定10】州l。134紙層析法分離測(cè)定肌苷紙層析法是以濾紙為惰性支持物，利用各種物質(zhì)不同的分配系數(shù)，使混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)而予以分離的方法。由于其設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉、所需樣品少、操作方便、分辨能力一般能達(dá)到要求等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。在肌苷的分析中，可以使用異丁醇：氨水，異丁酸：醋酸：氨水，正丁醇：醋酸：水等溶劑系統(tǒng)展層或雙向紙層撟”】。135電泳法測(cè)定肌苷帶電粒子在電場(chǎng)中向與其自身相反電荷的電極移動(dòng)稱為電泳(din yn)，紙電泳是以濾紙為支持物的電泳方法，包括(boku)常壓、高壓紙電泳。紙電泳與紙層析一樣

21、，操作較簡(jiǎn)便，尤其是通過使用高壓，大大縮短了分離(fnl)時(shí)間?，F(xiàn)在應(yīng)用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行朋著含量測(cè)定也取得了較好的效果|13】【14】。136薄層層析法分離測(cè)定肌苷薄層尉i是將作為固定相的支持劑涂于支持板上而進(jìn)行的一種層析技術(shù)。核酸類物質(zhì)的薄層層析是由蘭德拉思開發(fā)的。與紙層析等分離定量方法相比，薄層層析具有1前言層析速度陜、分離效果好、分辨力高、不產(chǎn)生拖尾及斑點(diǎn)、擴(kuò)蘸則、等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。有采用MN一纖維素EAE的薄層，以0L、05N鹽酸為展開溶劑分離了堿基、核苷和脫氧核苷。14肌苷的生產(chǎn)方法及生產(chǎn)概況肌苷生產(chǎn)方法有化學(xué)分解法和發(fā)酵法兩類，但目前在工業(yè)生產(chǎn)上實(shí)施的只有發(fā)酵法。發(fā)酵法就是利用微

22、生物的代謝作用，生物合成并過量積累肌苷，包括添加前體物發(fā)酵法和直接發(fā)酵法兩類。141肌苷的生產(chǎn)方法1411化學(xué)分解法核苷類物頁可用核糖核酸的化學(xué)分解法生產(chǎn)。用化學(xué)分解法分解RNA生產(chǎn)核苷的反應(yīng)，基本上是磷酸二酯的加水分解反應(yīng)。由于RNA是單核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵連接而構(gòu)成的，核苷酸為核苷的磷酸酯，故為了通過加水分解RNA來生產(chǎn)核苷，需要切斷核苷5-OH和3-OH位上結(jié)合的磷酸二酯鍵，并目進(jìn)步建立核苷不再分解的條件。由于工藝復(fù)雜、收率f氏、成本高等原因，在工業(yè)生產(chǎn)肌苷已不采用化學(xué)分解法，通常為發(fā)酵法吼1412直接發(fā)酵法直接發(fā)酵法是借助于微生物具有合成自身所需核苷的能力，通過對(duì)特定微生物的誘變

23、處理，選育出營養(yǎng)缺陷型及核苷結(jié)構(gòu)類1以物抗性突變株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?，從而達(dá)到過量積累某種核苷的目的。1413添加前體物發(fā)酵法添加前體物發(fā)酵法是利用核苷酸生物合成途徑(tjng)的補(bǔ)救途徑，通過在肌苷生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基中添加前體物次黃嘌呤，使嘌呤堿基通過補(bǔ)救途徑直接合成(hchng)核苷，從而增加肌苷的生成量。142肌苷的生產(chǎn)(shngchn)概況對(duì)肌苷等核酸類物質(zhì)的研究不過幾十年的時(shí)間，但取得了舉世矚目的成果。其研究起源于日本，1913年小玉新太郎等發(fā)現(xiàn)干松魚的鮮味是肌苷酸的組氨酸鹽，緊接著國中等人闡明了Y-IMP、5-GMP的呈味J生。最初，人們從一些天然物質(zhì)中提取制備肌苷

24、酸!(：5一。先從蛇毒、小腸粘膜提取蛇毒陡磷酸二酯酶，用該酬哿核酸中的AMP分解成游離狀態(tài)的Y-AMP，然后脫氨生成5-IMP。后來，又從干魚、烏賊肌肉中提取閨曙再生成Y-IMP。但是這樣的方法材料不易大量采取，產(chǎn)量很小，無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。1960年，國中、大村和緒方等砂酵母中提取RNA再酶解生產(chǎn)5JMP，創(chuàng)立了所謂二步發(fā)酵法畸，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。此方法的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、收率低、成本高。伴隨著二步發(fā)酵法的工業(yè)化生產(chǎn)，丌始了對(duì)不經(jīng)過RNA制備階段的一步發(fā)酵法天津科技大學(xué)碩=學(xué)位論文的研究。首先，罔林等、有馬等、古屋等、中山等經(jīng)過大量的研究實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，野生型菌株積累核酸類4頒的能力都很低，于是人們

25、開始將注意力轉(zhuǎn)向利用生化突變株生產(chǎn)核酸類物質(zhì)的研究。1957年，戈斛17J和帕特里奇掣1目先后發(fā)表了利用大腸桿菌和粗糙脈孢霉的腺嘌呤缺陷型菌株能在培養(yǎng)液中積累次黃嘌呤的報(bào)導(dǎo)，開刨了選育用于直接發(fā)酵法生產(chǎn)核酸類物質(zhì)的突變株的新紀(jì)元。1961年，Uchidatl91等首先報(bào)導(dǎo)了從Bacilius菌種的突變株來獲得肌苷。Aoldml腺嘌呤缺陷型BsubtiIis為出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，得到并分離出多重營養(yǎng)缺陷型突變株，其中C-30(ade，his-，廿n被發(fā)現(xiàn)具有低的肌苷分解活力，能夠積累63mgml肌苷。1967年，Nogami等從親株BacilluspNo 102得到一個(gè)具有腺嘌呤抗性的突變株，肌昔

26、累計(jì)達(dá)到117m咖l；隨后獲得具有低的核苷磷酸化酶活性的突變株，其同時(shí)積累的嘌呤堿基的量是可以忽略的。Shiio等從Bsubtilis RDA-16中獲得(hud)具有抗低水平8-氮烏嘌呤的突變株，它需要腺嘌呤，并且(bngqi)缺乏腺嘌呤脫胺酶活性，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)突變株的PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶不被嚎嘌呤(piolng)所抑制，能夠積累18mgml的肌苷。Enei等發(fā)現(xiàn)具有高的核苷酸酶活性的Bsubtilis AL 11044可以產(chǎn)肌苷209L。Matsui等同樣發(fā)現(xiàn)核苷酸酶活性在嘰苷積累中具有重要的作用，1980年得到蘇氨酸撓|生的Bsubtilis AL 11374，可以積累159L的肌昔，而其親

27、株只能積累099L肌苷。Miyagawn等通過NTG誘變得到的BsuboJis IFO 14189可以積累18罾E的肌苷。嘌呤核苷發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，不僅優(yōu)良的生產(chǎn)菌株選育是日n昔發(fā)酵的關(guān)鍵，而且由于任何菌株最終都必須落實(shí)到反應(yīng)器水平的發(fā)酵控制才能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。因而，發(fā)酵條件的控制對(duì)產(chǎn)苷也至關(guān)重要，甚至成為生產(chǎn)上影響產(chǎn)苷的主要因素。關(guān)于i匿岡攪拌剁斗對(duì)發(fā)酵的影響進(jìn)行了大量的研究。A出等發(fā)現(xiàn)搖飯發(fā)酵中肌苷積累的最適氧吸收速度系數(shù)趔為78104moUatmm1min，隨后的放大中提出以氧傳遞速率為依據(jù)調(diào)整空氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速，通過維持相當(dāng)成功地將搖瓶條件放大到50M反應(yīng)器規(guī)模。Shibai2

28、1刪等通過一系列研究發(fā)現(xiàn)枯草桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷時(shí)，通風(fēng)不僅起到供氧的作用，而且還具有降附著養(yǎng)液COz分壓的作用，培養(yǎng)基的高CO：分壓對(duì)嘰苷發(fā)酵有抑制作用，所以即使在供氧充分的條件下，若通氣量小起不到應(yīng)有的換氣效果，肌昔的積累也會(huì)受到抑制。國內(nèi)圍繞影口鏟苷的工藝進(jìn)行了大量的研究，張克旭掣船】通過均勻設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分、初始pH值、菌齡、通風(fēng)、溫度、溫度對(duì)產(chǎn)茜影響的研究，得到了較好的產(chǎn)螢得率。吳先道等人認(rèn)為不同發(fā)酵時(shí)期通過控制相應(yīng)的排氣C02量調(diào)節(jié)發(fā)酵通風(fēng)量有利于肌苷積累，對(duì)生產(chǎn)有指導(dǎo)意義；李崇等研究了通氣、攪拌、接種量及jf【力口補(bǔ)糖對(duì)產(chǎn)苷的影響；王夢(mèng)鶴等通過在2L發(fā)酵罐中調(diào)節(jié)通風(fēng)和轉(zhuǎn)速條件優(yōu)f藝工

29、藝使產(chǎn)苷提高約25；陳文元、李永刺14J等分別對(duì)肌苷發(fā)酵與分離耦合過程的優(yōu)化條件進(jìn)行了探討，研究表明該法與f可歇發(fā)酵相比能顯著(xinzh)提高產(chǎn)南巒率和產(chǎn)苷率。此外，已知補(bǔ)救途徑在發(fā)酵過捌空制中也司發(fā)揮(fhu)重要作用。1965年，1an0F25唧提出補(bǔ)救(bji)途徑螭埽；枯草芽1前言孢桿菌將外部添加的次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷的能力。陳家平等利用枯草芽孢桿菌7171-91菌株，在搖瓶中進(jìn)行添加次黃嘌呤試驗(yàn)，結(jié)果表明，添加1-5的次黃嘌呤均有利于肌營的積累，在發(fā)酵罐中添加l的次黃嘌呤使日n苷產(chǎn)量增產(chǎn)達(dá)30。莊賢軍、錢銘鏞等也證實(shí)培養(yǎng)基中添加次黃嘌呤可顯著提高產(chǎn)苷。此外，徐海等在靜息培養(yǎng)系統(tǒng)和20

30、噸發(fā)酵罐E都證實(shí)翹讎擰忝加次靜票呤可使朋苷得率得到提高。15肌苷的生物合成途徑及其代時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)制嘲肌苷的生物合成途徑及代i身f調(diào)節(jié)機(jī)制是定向選育肌苷生產(chǎn)菌的理論基礎(chǔ)。1959年，Buchanan等首先利用鴿肝勻漿研究了核苷酸的生物合成途徑。接著，Hartman、Most、Magasanik等又對(duì)此進(jìn)行了大量研究?，F(xiàn)已基本闡明枯草芽孢桿菌肌營生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，并預(yù)測(cè)了朋苷生產(chǎn)菌的定向育種途徑。151肌苷的生物合成途徑 核苷酸的生物合喲黼兩條，一條是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5i磷酸核糖為出發(fā)物質(zhì)的全合成途徑(denovopathway)，一條是由嘌呤堿基由于核糖基化及磷酸化而合成的補(bǔ)救途

31、徑(salvagepathway)。Nishikawa等對(duì)枯草芽孢桿靜票呤核苷酸的生物合崗鑫徑的研究結(jié)果表明，葡萄糖經(jīng)HMP途徑生成5-磷酸核糖，從5埔酸核糖經(jīng)過11步酶促反應(yīng)生成肌苷的直接前體物IMP。IMP再經(jīng)脫磷酸化轉(zhuǎn)化為肌苷。同時(shí)在枯草芽孢桿菌中，從IMP開始分出兩條環(huán)形路線：一條是經(jīng)過XMP合成GMP,再經(jīng)GMP還原酶的作用生成IMP；另一條是經(jīng)A立SAMe合成AA佃，再經(jīng)過AMP脫氨酶的作用生成IMP，從而實(shí)現(xiàn)AMP和GMP的相互轉(zhuǎn)變。在枯草芽孢桿菌中，嘌呤核苷酸的全合成途徑如圖1-1所示。由此可見，IMP是肌苷的直接前體物，IMP由全合成途徑生成后，再經(jīng)脫磷酸化即轉(zhuǎn)變?yōu)榧∥簟?6

32、i堡!壟盔蘭堡圭蘭堡堡苧一拔蒲器鼢OH PRj干音戒礴 OH零。娑PRPP引黼= 。轉(zhuǎn)蔬艘酶 6H b占。磷酸_蔓搪熊磷靛ff壤PPw”如薔 簍良。爭(zhēng)“”qnM一。剛張=：眙螨“。fNH()=tV阿)j。碡酸梭搪瞎rPRA)甘氟盛+A1pADp+HP(監(jiān)。Ni，N】o甲。THF+眥OTH譬。oo1：，=-一 辯艘接蛞甘氟礴轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)(zhun zhun)甲蹴謦甲酰甘氰瞧轄括背緩fFGAR)”： (】(虻一H，N80H。ji：ii瓦iiH：N一 盤一5鈕崔味畦核拌醴rAfR)s-氯蓮一4甲酸(ji sun)噼唑豐薹苷酸(CAIR)嘞0l坪化脫水爵t IMPd幽 hy蚓”)5二礬苷醵(5-fMPjCXE

33、挺丁坶二二5甲最胺-4-氰甲酰瞇唑棱替融(FAIcAR)r鋱?bào)y鞍技瞽酸(GAR)0()C57栽驀-4。(_一驍珀基)代鋱審酰睬矬核苷酸(SAICAR)l餾鬻k反二：啦ofHN，C、(：N州0N HiNC、，cH知岣 昧鑫辮器是畚，AMp GMP圖卜1嘌呤(piolng)核苷酸的全合成途徑瞻11 Denovopathwayofpurineril=，0nuclcotidebiosynthb7o函心、奠 “醚_菪 挈?瞄 專傭。P礦、MI州姐吣 孽一 州1前言(qin yn)此外(cwi)，在肌苷的發(fā)酵生產(chǎn)中，補(bǔ)救途徑亦具有重要的功能，當(dāng)全合成途徑受阻時(shí)，微劃勿可通過j笏輯睞合廊獺著酸。嘲途徑也；際

34、分段合髓姑豆B鉿屆遴徑，是旨微生物從培養(yǎng)基中取得完整的嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸通過酶促反應(yīng)直接合成單核苷酸。與補(bǔ)救途徑有關(guān)的酶包括核苷磷酸化酶(堿基+R_1-P一核苷+Pi)、核苷酸焦磷酸化酶(堿基+PI岍，一51一核昔酸+P峨)和核苷酸磷酸激酶(核苷江P5i核苷酸+ADP)。其中最為重要的是核苷酸焦磷酸化酶所催化的反應(yīng)?？莶菅挎邨U菌能利用外部添加的次黃嘌呤，通過核苷酸焦磷酸化酶的作用，使嘌呤日或基與PRPP合成為相應(yīng)的嘌呤核苷酸。肌苛生物合成的補(bǔ)救途徑如圖1-2所示。核苷酸 p核苷ADP ATP圖1-2嘌呤堿基、核苷和核苷酸的相互轉(zhuǎn)變的補(bǔ)救途徑lVlg1-2 Salvagepathwayof

35、tranformamonglmrinebasBribonudeosideandnbonuclcofide152肌苷合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)枯草芽黼：菌的研究結(jié)果表明，在AMP生物合成途徑中專性酶(SAMP合成酶)僅受AMP系物質(zhì)的反饋?zhàn)瓒?，GMP生物合成途徑中專性酶(IMP脫氫酶)僅受OMP系物質(zhì)的反饋?zhàn)瓒簦cAMP、GMP合成共用的IMP生物合成有關(guān)的酶(IMP轉(zhuǎn)甲酰酶、SAMP裂解酶、P砒甲轉(zhuǎn)酰胺酶)受AMP系、GMP系任物質(zhì)的反饋?zhàn)瓒簟Ａ硗?，嘌呤核苷酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶有PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶、IMP脫氫酶和 SAMP合成酶。其中，唧轉(zhuǎn)酰胺酶特異煅Ah佃、ADP的完全反饋抑制，但也受IMP、G

36、MP、XMP和ATP的抑制，不過抑制程度較弱。IMP脫氫酶受GMP最強(qiáng)的反饋(fnku)抑制(58)，其次是如=P GO)、XMP(39)、GTP(26)的反饋抑制。綜合上述結(jié)果，枯草芽孢桿菌中嘌呤(piolng)核苷酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制是，在AMP的生物(shngw)合成中，PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶受AMP的反饋抑制，IMP生物合成系的酶和AMP生物合成系的酶受腺嘌呤系化合物的反饋?zhàn)瓒?。在GMP的生物合成中，IMP脫氫酶受GMP的反饋抑制，IMP生物合成系的酶和GMP生物合成系的酶受GMP的反饋?zhàn)瓒?，從IMP合成AMP、GMP，傾向于優(yōu)先合成GMP。天津科技大學(xué)頊?zhǔn)繉W(xué)位論文PRPP+臺(tái)成途徑優(yōu)先合成

37、反饋抑制反饋?zhàn)桢輕圖1-3枯草芽孢稈菌中嘌呤核苷酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制Fig1-3 M曲Ib0艋cl鼬蚰nn搬由aIl劬ofpu豳eb0Il嘴k嘣deiIl且捌酗治當(dāng)培養(yǎng)基中腺嘌嶺和鳥嘌呤過剩時(shí)，腺嘌呤和鳥嘌呤便對(duì)P磁中轉(zhuǎn)酰胺酶產(chǎn)生阻 遏作用，使萄濰通過補(bǔ)蝴合成嘌呤核苷酸。但是，補(bǔ)救甚陘也存舀玳謝調(diào)控問題。已知在枯草芽孢桿菌中，補(bǔ)救途徑中的酶核苷酸磷酸化酶、核苷酸焦磷酸化酶及核苷酸磷酸激酶等所催化的反應(yīng)亦為多種嘌呤核苷酸所抑制，如XMP焦磷酸化酶受到GTP特別強(qiáng)烈的反饋抑制。16肌苷產(chǎn)生菌育種思路根據(jù)豐古草芽孢桿菌生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制及成功的育種實(shí)例，肌苷生產(chǎn)菌的定向育種途徑如下：161選擇5

38、-核苷酸酶活力強(qiáng)的菌株由5-肌苷酸生成肌苷的反應(yīng)由5-核苷酸酶所催化，5一核苷酸酶活力強(qiáng)，則有利于5一肌苷酸轉(zhuǎn)化成且門苷，從而使肌昔得以大量積累。實(shí)踐表明，以具有一定產(chǎn)苷能力的枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌株，更有希望在短期內(nèi)獲得肌苷高產(chǎn)菌。162,切斷支路代謝(1) 選育喪失SAMP合成酶的突變株，即腺嘌呤缺陷突變株，可切斷從IMP到AMP支g射啪十，通過限量；忝加腺嘌呤榴除腺嘌嶺系化合物對(duì)m生物臺(tái)成的反饋調(diào)節(jié)，增加肌苷前體物IMP的積累。(2) 選育喪失IMP脫氫酶或XMP氨化酶的突變株，即黃嘌呤缺陷突變株或鳥嘌呤缺陷(quxin)突變侏，通過限量添加黃嘌呤或鳥嘌呤來解除鳥嘌呤系化合物對(duì)IMP生物

39、合成的反饋調(diào)節(jié)(tioji)，增加肌昔前體物IMP的積累。(3) 選育(xun y)Ade一+X鯽或Ade一+Gu雙重缺陷突變株，切斷IMP到AMP和IMP到GMP兩條支路代謝，通過限量控制腺嘌呤和黃嘌呤或鳥嘌呤來解除腺嘿呤和1前言鳥嘌呤系化合物對(duì)IMP生物合成的反饋調(diào)節(jié)，使IMP大量積累，從而使肌苷得以大量積累。(4) 選育硫胺素缺陷突變株和組氨酸缺陷突變株，分別切斷CAlR至I硫胺素和從AICAR到組氨酸的支咯f鋤，加強(qiáng)主代謝漉，從而增加肌苷的積累。(5) 選育核苷磷酸化酶活力微弱或喪失的突變株，使生成的肌苷不再分解成次黃嘌呤。163解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)通過選育抗腺嘌呤、鳥嘌呤結(jié)構(gòu)類似物

40、如8AG、6-M1。、8(r等與(或)抗磺胺類藥物如SGr、S下等突變株，造就肌遺傳上解除正常代謝調(diào)控的理想菌株。這是因?yàn)?，菌體帶上彳弋鞠封茜抗物抗陛標(biāo)記后，一個(gè)可能途徑是關(guān)鍵酶(如PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶)的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)部位不再自躋口效應(yīng)物結(jié)合，而滑陡中心部位卻不變，因此當(dāng)細(xì)胞中已有大量最終產(chǎn)物時(shí)仍能繼續(xù)合崩亥產(chǎn)物。另個(gè)可能途徑是調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，使阻遏物不再能和效應(yīng)物結(jié)合，因此當(dāng)細(xì)胞中已有大量最終產(chǎn)物時(shí)，由于其不自邑與阻遙物相結(jié)合，故仍能繼續(xù)合成有關(guān)的酶。在肌苷生產(chǎn)菌的選育中，常用的代謝拮抗物主要有8氮腺嘌呤、8氨鳥嘌呤、6_巰基嘌呤、磺胺胍、磺膠噠嗪、磺胺嘧啶等。164增加前

41、體物的合成由于肌苷生物合成的最初前體物是5塒牾僉陔糖，所以選育喪失轉(zhuǎn)酮酶活力的突變株，可以切斷HMP途徑中該酶所催化的反應(yīng)，使5一磷酸核糖的積累增加，從而增加肌苷生物合成的主代謝流。選育轉(zhuǎn)酮酶缺陷的方法是：選育不利用肛葡萄糖酸或L 阿拉伯糖等必須通過磷酸燃趟新亍代謝的糖類的突變株，或者選育莽草酸缺陷突變株?？傊?，以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，肌苷高產(chǎn)菌直該具有以下標(biāo)記，即：Ade一+Xan一+His-+8-AG+SG+NP一-kSmr+dea-+GMPred-+Gu一。165睨苷產(chǎn)生菌育種實(shí)例1967年，百瀨等、佐藤等、石井(sh jn)等對(duì)芽孢桿菌屬嘌呤核苷酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)篇!Ji掛亍了深

42、入的研究(ynji)，發(fā)現(xiàn)了系列(xli)嘌吟核苷酸類物質(zhì)的發(fā)酵機(jī)制。1969年，奈良、木下祝郎等對(duì)產(chǎn)氨短桿菌嘌呤核苷酸類物質(zhì)的生物合成調(diào)節(jié)機(jī)制也進(jìn)行了研究，為核酸類物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)，為肌苷生產(chǎn)菌的育種工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。以后，陸續(xù)選出了許多肌苷生產(chǎn)菌株，包括枯草芽孢桿菌、短小芽融桿菌、產(chǎn)氨短桿菌及其他微生物等。19681980年枯草桿菌No102經(jīng)過紫外線照射和DNA轉(zhuǎn)化法得到腺嘌呤和黃瞟呤雙重缺陷型，并對(duì)8氮雜鳥嘌呤有抗l生的突變株(G3-46226)。突變株可以生成223島幾的肌苷，或在次黃嘌呤(1)存在下，生成331舀L的肌苷。1976年將產(chǎn)氨短桿菌突變株ATCC6872

43、用NTG處理后，在涂布于含有6一疏基鳥嘌呤的培養(yǎng)基上，由此選出菌株ATCC21477。用各種阻遏劑及抑制劑孫童些突變株與天津科投大學(xué)碩士學(xué)位論文親株進(jìn)行比書獼疆瞼。結(jié)果ATCC21477的IMP生物合成的酶系不受阻遏劑阻遏，也不受抑制劑的抑制。將ATCC21477再用藥劑處理，獲得腺嘌呤和鳥嘌呤雙重缺陷型突變株衄CCl480，可產(chǎn)肌苷高達(dá)5249jL。1973年，還選得了短小芽孢桿菌肌苷生產(chǎn)菌ASB-57418021，可產(chǎn)肌苷849L。恢菌是腺嘌呤、蘇氨酸、組氨酸三重缺陷型。相比之下，我國的肌昔工業(yè)起步較晚，與先進(jìn)水平有一定差距。但經(jīng)我國科學(xué)工作者的努力，取得了很大的進(jìn)展。1972年，中國科學(xué)

44、院上海生化所以枯草桿菌No101為出發(fā)菌株選得具腺嘌呤、硫胺素缺陷型的菌株7171D1，產(chǎn)苷11659L281。1986年，復(fù)旦大學(xué)選得FD8601，在5L自控罐E發(fā)酵可產(chǎn)苷2659U凹3。1984年，江蘇微生物研究胛劃以717161為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變處理，獲得一株具有腺嘌呤、組氨酸、硫胺索三重缺陷并對(duì)8-氮雜鳥嘌呤、6一巰基嘌呤具有撓f生的突變株JS餌1019，該菌株搖20釅L。天津輕工業(yè)學(xué)院張克旭、陳寧等近來對(duì)日n苷萄粥是育做了大量研究，通過誘變、轉(zhuǎn)化、融合等方法選得多株肌苷高產(chǎn)彥爭(zhēng)矧，最高達(dá)2785扎。南開大學(xué)的王岳五、張蓓等將原生質(zhì)體誘變(yu bin)技術(shù)蝴獰硼昔生產(chǎn)菌株的選育，證明

45、非常有效【31l。17代謝工程與肌苷工程菌的構(gòu)建(u jin)代謝工程玨剴是指應(yīng)用(yngyng)重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分子生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進(jìn)行有精確目標(biāo)的遺傳操作，改變酶的功能和輸送體系的功能，甚至產(chǎn)能體系的功能，以改進(jìn)微生物細(xì)胞某些方面的代謝清生的整套工作(包括代謝分析，代謝設(shè)計(jì)，遺傳操作，目的代謝活l生的實(shí)現(xiàn)等)。代謝工程的目標(biāo)是修飾初級(jí)代謝，將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率。隨著代自扛程與各種學(xué)科知識(shí)的融合，越來越多的研究方法和策略被應(yīng)用于代謝工程的研究。1、分子生物學(xué)方法構(gòu)建特殊的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，尤其對(duì)于具有較高生產(chǎn)價(jià)值的教生物，具有重要意義。例如在棒桿菌中

46、，通過尋找土著質(zhì)粒，利用不同的啟動(dòng)子構(gòu)建特殊的載體，實(shí)現(xiàn)了外源基因在棒桿菌中的表達(dá)。2、分析化學(xué)及檢測(cè)方法代謝工程的研究對(duì)象是代謝途徑，因此必須對(duì)代謝通路中的些酶及產(chǎn)物進(jìn)行研究和分析$倒。傳統(tǒng)的分析通路的手段有：物質(zhì)平衡、同位素標(biāo)記、分離障礙突變株等，目前它們?nèi)匀皇潜夭豢缮俚氖侄?，而核磁共振、流氏?xì)胞術(shù)的應(yīng)用則為這領(lǐng)域的發(fā)展增添了新的活力。3、數(shù)學(xué)及計(jì)算機(jī)工具研字科弋詡j工程不僅需要遺傳學(xué)知識(shí)，而且需要對(duì)宿主菌的生化代謝途徑和生理學(xué)有深入的了解，所以有效地將DNA數(shù)據(jù)庫的信息應(yīng)用于代謝工程并開發(fā)出適合的軟件系統(tǒng)，有利于代謝工程的發(fā)展。隨著研究的深入，用整體系統(tǒng)觀念來研究細(xì)胞越來越顯得重要。相關(guān)

47、的代謝工程1前言理謝姍91也在不斷發(fā)展。新的檢測(cè)手段及數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)方法的應(yīng)用，為人們提供了設(shè)計(jì)和改造微生物的條件，代謝工程為發(fā)展更為復(fù)雜的組織工程、基因治療直至整個(gè)生命的工程奠定了基礎(chǔ)。171基于代謝工程理論的肌苷工程菌構(gòu)建的具體思路代i身工程的具體思路和常規(guī)誘變育種技術(shù)有所不同。(1)改變代謝流：改變分支代謝途徑(tjng)的流量，阻斷有害產(chǎn)物。可采駁如下措施：a加速限速反應(yīng)。通過克隆對(duì)生物合成起限速作用的關(guān)鍵(gunjin)酶基因，加速代謝流的流動(dòng)(lidng)。b構(gòu)建弋謝旁路。用代謂扭程的方法可以阻斷或降f氏副產(chǎn)物的合成，特別是有毒產(chǎn)物的產(chǎn)生。c改變能量代謝途徑。d改變分支代謝途徑的流量

48、。通過提高代謝分叉點(diǎn)的某一個(gè)分支代謝途徑酶系的活力，以得到高產(chǎn)的末端代謝產(chǎn)物。(2)擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑：通過引入外源基因，可以延伸原來的代謝途徑，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物，或者利用新的底物作為生物合成的原料，也可構(gòu)建新的代_【9jj鑫徑來合成具有新化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物。a延伸代謝途徑。b構(gòu)建新的生物合成途徑。1,2肌苷工程菌的構(gòu)建刪從理論上講，肌苷工程菌的構(gòu)建策略有下列幾種：第一，借助于基因克隆與表達(dá)技術(shù)，將肌苷生物合成途徑中的限速酶編碼基因?qū)肷a(chǎn)菌中，通過增加基因劑量和 (或)更換表達(dá)調(diào)控條件，擴(kuò)增其表達(dá)。導(dǎo)入的限蠛因既可以是生產(chǎn)菌自身的內(nèi)源基因，也可以是來自非生產(chǎn)菌(如大腸桿菌)的

49、外源基因：第二，采取類似的方法，擴(kuò)增表達(dá)jj1著輸出系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，或者降低某些基因產(chǎn)物的表達(dá)速率，最大限度地解除肌苷及其生物全合成中間產(chǎn)物對(duì)某生物合J$獪徑可能造成的反饋抑制；第三，將多種完整的核苷生物合成操縱子導(dǎo)入另種核昔生產(chǎn)菌中，構(gòu)建能同時(shí)生成兩種甚至多種核苷的工程菌。實(shí)施L述戰(zhàn)略的第一步是有關(guān)基因的克隆，特別是限速酶基因的擴(kuò)增。生物體內(nèi)負(fù)責(zé)催化從PRPP到IMP反應(yīng)步聚有10個(gè)酶，分別由put基因系列負(fù)責(zé)編碼，其中限速酶之一PRPP轉(zhuǎn)酰8安酶是pufF基因的產(chǎn)物。在大腸桿菌中，pufF位于一個(gè)三基因的操縱子中，其它兩個(gè)基因的功能尚不清楚：offl62zpurF-dedF。一個(gè)與啟動(dòng)子相

50、鄰的開放式閱讀框(open reading fiame，D一負(fù)責(zé)編碼一條162個(gè)氨基酸殘基的肽鏈：dedF是操縱子的末端基因。啟動(dòng)(qdng)基因位于35位和10位的基因之帆操縱子的位置在一26和一27位問變化，并且(bngqi)在操縱子位至少有一個(gè)是purF基因阻遏物作用的位點(diǎn)。在大腸桿菌(d chn n jn)細(xì)胞中伊受purR基因編碼的阻遏物所調(diào)控，purR還負(fù)責(zé)編碼調(diào)控朋rC，講f也、purE、purHJD和purM基因的陽遏4驢”。12天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文由于大腸桿菌被視為原核生物基因表達(dá)的典范，因此對(duì)枯草芽褂F菌中基因組合和調(diào)控與生物合成代謝的關(guān)系的研究較少。但是枯草芽孢桿菌中

51、的基因類型和代謝途徑等與腸道細(xì)菌的有所區(qū)別f42j?？莶菅挎哞叹衟ur操縱子基因排列順序?yàn)閜urEKBC(orf)QLMNH(J)D，如圖1_4所示。箭頭處為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄起始于pure基因上游242bp處的一個(gè)643啟動(dòng)子，終止于purD下游約38個(gè)核營酸處。在大腸桿菌中，除了操縱子purH(J)D,purMN和purEK連緲p，其它操縱子不連續(xù)，因此，在大腸桿菌中IMP全臺(tái)成途徑的pur基因是分散的。而枯草芽孢桿菌中，它們處于一個(gè) 操縱子中。對(duì)枯草芽孢桿菌中許多pur基因而言，3、端的某個(gè)編晌嶼其相鄰的下游5、端的編碼序列均有重疊，如；purE-purK,8bp；purK-purB，

52、4bp；purC-orf,8bp；or媽vurQ,4bp；purQ-p_cwL，17bp；purL-purF,25bp；purM-purN,4bp；以及purN-purH(J)，4bp。這樣pur操縱子形成了三個(gè)基因組與一個(gè)米端基因：purEKBpurC(orJ)QLF-purMNH(J)-purD。割項(xiàng)反子間的距離分別為：purB-purC,73bp；purF-purM,lOlbp；purH(J)-purD,15bp。而大腸桿菌中的p計(jì)基因分散于染色體中，因此鼢見到重疊的基因簇。0士 亡c乒=j3蔓二巴F二=毛了=f=乇=二二匕口u姑purK pu曲 pur亡 塒埔purl pufF Du巾

53、 Pu氓 rH CJ)purI圖1_4枯草芽孢桿菌中刪基因分布示意圖F毽1-4scllema血d缸g嗡msoftheBacRussub礎(chǔ)s pt時(shí)moperons枯草芽孢桿菌中的p基因調(diào)控按照轉(zhuǎn)錄的終止-反終止模型進(jìn)行(圖15)【觀1。圖中第一條線表示在啟動(dòng)子(箭頭所示)矛旺第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因位置之問的DNA區(qū)域。字母和箭頭方向表示了基因的對(duì)稱性。第二條線表示早熟的轉(zhuǎn)錄終止的mRNA。線上的圓形表示被鳥嘌呤核苷酸激活生成(shn chn)的調(diào)控分子，與A片段結(jié)合。對(duì)稱基因c和D可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即a-獨(dú)立(dl)轉(zhuǎn)錄終止子。第三條線為對(duì)稱基因A和B形成的競(jìng)爭(zhēng)l生的二級(jí)結(jié)構(gòu)，去除轉(zhuǎn)錄終止作用(zuyn

54、g)。AB形成的該二級(jí)結(jié)構(gòu)具有反終止子的作用。鳥嘌呤核苷酸抑制了酶的合成是由于在f獨(dú)立轉(zhuǎn)錄終止位置形成了早熟mRNA，早熟的mRNA是在5端啟動(dòng)子區(qū)開始轉(zhuǎn)錄，在未進(jìn)入結(jié)構(gòu)基因區(qū)域就終止了轉(zhuǎn)錄。已證明腺嘌呤核苷酸是通過抑制轉(zhuǎn)錄的起始來發(fā)揮作用的。 亡二蘭之蘭蘭三蘭麗F一，；。，=。：，丑。， ：畦一圖1巧枯草芽孢桿菌中叫”基因調(diào)控的終也反終止模型1前言一霹1-5|l腳嗡讎唧代鯽【lta拄啦l 0tlhe扯m哪咖硼讎mI咖m0吐dforregulationoftheB礎(chǔ)塒曲p吖ope10uis由噠代謝調(diào)節(jié)機(jī)制可知，要構(gòu)建8H苷工程菌株，就必須要滿足下面一些條件：(1)具有有效的5-核苷酸酶。(2)

55、將肌苷分解為次黃嘌呤的核苷酶活力低下或喪失。(3)解除菌體自身所受的代謝調(diào)控。(4)增加前體物，阻斷代謝支路。因此，肌苷工程菌理想的生物合成途徑應(yīng)該如圖1-6所示。OR5P8丹AMPtSAMP、 墨I(xiàn)R 寸忸怕Gm圖1-6肌昔工程菌理想生物合成邕徑n昏1-6 Idealbiosynthesispathwayofinosineengineeringstrain18肌苷的發(fā)酵控制【43】 -肌昔發(fā)酵是典型的代19控偉4發(fā)酵，刁鄧虢良的生產(chǎn)菌棟選育是肌苷發(fā)酵的關(guān)踺，而且由于任何菌株最終都必須落實(shí)到反應(yīng)器水平的發(fā)孬控制才信鈕凋于實(shí)際生產(chǎn)。因而，發(fā)酵條件的控制對(duì)產(chǎn)舒也至關(guān)重要，甚至成為生產(chǎn)上影響產(chǎn)營的主

56、要因素。181碳源和氮源對(duì)產(chǎn)苷的影響碳源是構(gòu)成菌體和合成肌苷的碳架及能量來源。氮源不僅是構(gòu)成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)的來源，而且是合成肌苷堿基部分的來源。肌苷發(fā)酵的常用的碳源為葡萄糖、淀粉等，實(shí)驗(yàn)室常用碳源為葡萄糖；氮源可采用酵母粉、蛋白胨、玉米漿、豆?jié)獾龋瑢?shí)驗(yàn)室常用氮源為玉米漿、酵母粉、豆?jié)?、硫酸銨、尿素(nio s)等。培養(yǎng)基中糖濃度對(duì)肌苷發(fā)酵(f jio)有很大的影響。在一定的范圍內(nèi)，肌苷的產(chǎn)量隨糖濃度的增加而增加，但達(dá)到一定的限度，糖濃度過高，由于(yuy)滲透壓增大，14天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文對(duì)菌體生長和發(fā)酵均不利，當(dāng)工藝條件配合不當(dāng)時(shí)肌苷對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率反而降低。同時(shí)培養(yǎng)基濃度太大

57、，氧溶解的阻力大，影響供氧效率，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)苷不利。此外，在同等條件下，選擇恰當(dāng)?shù)奶荚春偷磁浔葘?duì)發(fā)酵有很大的影響。182無機(jī)鹽及生長因子對(duì)產(chǎn)苷的影響無機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)。其主要功能是構(gòu)成菌體成分；作為酶的組成部分；酶的激活劑或抑制劑；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓；調(diào)節(jié)pH值和氧化還原電位等。一般微生物所需要的無機(jī)鹽為硫酸鹽、磷酸鹽和含鉀、鈉、鎂、鐵的化合物。微生物對(duì)無機(jī)鹽的需要量很少，但無機(jī)鹽含量對(duì)菌體生長和代謝產(chǎn)物的生成影響很大。生長因子是一類對(duì)微生物正常代謝必不可少卻不能用簡(jiǎn)單的碳源或氮源自身合成的有機(jī)物。在配制培養(yǎng)基時(shí)，可通過加入富含生長因子的原料一酵母膏、玉米漿、麥芽汁、豆餅水解

58、液等起作用。183溫度、pit對(duì)產(chǎn)苷的影響據(jù)報(bào)道，肌苷發(fā)酵的培養(yǎng)溫度可采用32、34、36 6C等；初始的pH可以為68、70、72等。19菌種保藏肌苷生產(chǎn)菌與其他菌種一樣，經(jīng)誘變獲得，很可能由于回復(fù)突變(突變率10。104)喪失其優(yōu)良性狀。根據(jù)肌苷生產(chǎn)菌的生理生化特征，參考經(jīng)典試驗(yàn)方法，采取如下措施：選育遺傳穩(wěn)定的菌種，定期進(jìn)行分純，復(fù)壯，保藏培養(yǎng)基中加入必需營養(yǎng)物質(zhì)以及抗性物質(zhì)等。110論文立題背景及主要研究?jī)?nèi)容在食品工業(yè)中，肌苷主要是用于二步法生產(chǎn)5一肌苷酸，由于對(duì)食品增味劑需求的增加和對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷正在成為生產(chǎn)第二代和第三代增鮮劑的主要途徑，取代了化學(xué)合成法和水解

59、法；此外，肌苷被用于生產(chǎn)各種藥物及其前體物、功能f生食品等，其市場(chǎng)前景也相當(dāng)樂觀。但是，近年來隨著日本、韓國等廠家對(duì)中國市場(chǎng)的沖擊，國內(nèi)的肌苷發(fā)酵產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。與國際市場(chǎng)需求每年10一20的增幅相反，國內(nèi)的生產(chǎn)企業(yè)卻面臨轉(zhuǎn)產(chǎn)、停產(chǎn)的威脅，為此從本質(zhì)上提高發(fā)酵得率、阿氏生產(chǎn)成本，進(jìn)而提高生產(chǎn)能力已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急，迅速提高我國在這方面的技術(shù)水平必將產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益，并且對(duì)自11強(qiáng)國內(nèi)肌昔發(fā)酵工業(yè)在國際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)自幼也有著重要的意義。本課題的主要研究?jī)?nèi)容包括：1建立一種快速簡(jiǎn)便的肌苷測(cè)定方法；2以枯草芽孢桿菌TY一21為出發(fā)菌株，通過硫酸二乙酯(DES)誘變，定向選育(xun y)出一株

60、遺傳穩(wěn)定的肌苷高產(chǎn)菌；3對(duì)選育獲得(hud)的肌苷高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶分批發(fā)酵試驗(yàn)，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)和模式識(shí)別方法優(yōu)化出最佳種子(zhng zi)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成并確定種子和發(fā)酵培1前言養(yǎng)條件；f41以搖瓶分批發(fā)酵最優(yōu)條件為基礎(chǔ)，進(jìn)行5L罐分批發(fā)酵試驗(yàn)?；阝锊菅挎邨U菌的肌苷生物合成途徑和文獻(xiàn)資料建立肌苷合成代謝網(wǎng)絡(luò)，并基于化學(xué)計(jì)量式建立肌苷的代謝流量平衡模型，應(yīng)用此代謝流量平衡模型通過M柵AB軟件線生規(guī)劃得到8n苷理想代謝流分布以及各種極端青況自釬弋謝流分布，計(jì)算肌苷發(fā)酵中后期的代謝流分布。通過對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的定量分析以期為肌苷產(chǎn)生菌的遺Jf專操作和發(fā)酵控制提供理論指導(dǎo)。16。天津科技大學(xué)碩士學(xué)位