實驗九噬菌體效價測定

1、關(guān)于實驗九噬菌體效價的測定第一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月目的要求1、掌握噬菌體效價測定的原理及方法2、觀察噬菌斑的形態(tài)第二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月實 驗 內(nèi) 容 一培養(yǎng)基和實驗物品的準(zhǔn)備第三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月本次實驗準(zhǔn)備工作（2人/組）1、配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液（ pH 7.4-7.6 ）； （已準(zhǔn)備好）。2、測定效價時稀釋用9ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液 3支/組，分裝于18180mm試管；3、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（1.5%的瓊脂）底層用，100ml/組，裝于250ml三角瓶， （用于制備6個無菌平板，倒薄一點）4、上層用5ml牛肉膏蛋

2、白胨半固體培養(yǎng)基（0.8 %的瓊脂），融化后分裝于15150mm試管中加塞包扎滅菌，6支/組； （教師已準(zhǔn)備好）5、1ml無菌吸管 5支/組。第四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月實 驗 內(nèi) 容 二噬菌體知識介紹第五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、幾個重要概念1、噬菌體：是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，分布極廣，個體很小，在光學(xué)顯微鏡下看不見，需用電鏡觀察。不同的噬菌體在電鏡下有三種形態(tài)：蝌蚪形、微球形和絲形。大多數(shù)噬菌體呈蝌蚪形，由頭部和尾部兩部分組成。第六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月2、噬菌斑： 在混濁的細(xì)菌菌面（菌苔）上形成的透明區(qū)域，是由噬

3、菌體不斷侵染宿主細(xì)胞裂解形成的，其形狀、大小不等。3、噬菌體效價： 指1mL樣品中所含具有侵染活性的噬菌體（烈性噬菌體）數(shù)量噬菌斑形成單位（pfu，plaque-forming unit）。效價（titre，titer）這一名詞在不同的場合有其不同的含義（如抗生素等）。第七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、病毒粒子的構(gòu)造（模型）第八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的形態(tài)及分類科屬第九張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖第十張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖及電鏡照片頭部六角形基板領(lǐng)環(huán)螺旋形尾鞘核心或管（中

4、空）尾刺或刺突尾絲第十一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌斑示意照片宿主細(xì)菌菌苔噬菌斑第十二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌T噬菌斑的表型形態(tài)第十三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體的分類根據(jù)噬菌體與宿主菌的相互關(guān)系烈性噬菌體（virulent phage） 能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。溫和噬菌體（temperate phage） 噬菌體基因與宿主染色體整合，不產(chǎn)生子代噬菌體，但噬菌體DNA能隨細(xì)菌DNA復(fù)制，并隨細(xì)菌的分裂而傳代，存在游離態(tài)、整合態(tài)、營養(yǎng)態(tài)三種形式。針對溫和噬菌體來說：前（原）噬菌體、溶源菌第十四張，P

5、PT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、噬菌體繁殖（生活周期）1、吸附2、侵入3、增殖（生物合成）4、成熟裝配5、裂解釋放第十五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月T4噬菌體吸附和DNA的注入第十六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月T偶數(shù)噬菌體感染大腸桿菌的掃描電鏡照片第十七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月T4噬菌體的生活周期第十八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月T4噬菌體的裝配第十九張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、噬菌體的應(yīng)用1、細(xì)菌的鑒定與分型 噬菌體與宿主菌的關(guān)系具有高度特異性，即一種噬菌體只能裂解一種和它相應(yīng)的細(xì)菌，故可用于未知細(xì)菌的鑒定和分型。2、

6、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)研究的重要工具 噬菌體基因數(shù)量少，結(jié)構(gòu)比細(xì)菌和高等細(xì)胞簡單得多，且易獲得大量的突變體構(gòu)建基因文庫（噬菌體）；基因工程載體；噬菌體展示技術(shù)。第二十張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、細(xì)菌感染的診斷與治療 利用其專一性，可以診斷和治療一些相關(guān)細(xì)菌感染性疾?。ㄓ糜谥委煏r，其分泌的細(xì)菌素也可以應(yīng)用，臨床外傷治療已有應(yīng)用） 但專一性也限制了噬菌體在臨床上的廣泛應(yīng)用（人們最需要的是廣譜性）。第二十一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月六、噬菌體的危害在工業(yè)上會造成所培養(yǎng)菌體的大量裂解，使生產(chǎn)難以完成。表現(xiàn)形式：發(fā)酵周期明顯延長；碳源消耗緩慢；發(fā)酵液變清，鏡檢時，有大量異常菌體

7、出現(xiàn)；發(fā)酵產(chǎn)物的形成緩慢或根本不形成；用敏感菌作平板檢查時，出現(xiàn)大量噬菌斑；用電子顯微鏡觀察時，可見到有無數(shù)噬菌體粒子存在。輕則延長發(fā)酵周期、影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，重則引起倒罐甚至使工廠被迫停產(chǎn)。第二十二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月七、以防為主的措施：1、決不使用可疑菌種； 2、嚴(yán)格保持環(huán)境衛(wèi)生；3、決不排放或隨便丟棄活菌液；4、注意通氣質(zhì)量 空氣過濾器要保證質(zhì)量并經(jīng)常進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，空氣壓縮機的取風(fēng)口應(yīng)設(shè)在3040米高空；5、加強管道及發(fā)酵罐的滅菌；6、不斷篩選抗性菌種，并經(jīng)常輪換生產(chǎn)菌種；7、嚴(yán)格執(zhí)行會客制度。第二十三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月實 驗 內(nèi) 容 三噬菌

8、體效價的測定第二十四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、噬菌體效價測定的方法（梯度稀釋）斑點試驗法涂菌平板上滴加稀釋液液體稀釋試管法以不長菌判斷（澄清）雙層平板法最常用，相對單層優(yōu)點較多單層平板法載玻片法快速其它病毒的效價（計數(shù)）測定空斑計數(shù)、電子顯微鏡直接計數(shù)、免疫學(xué)間接測定（凝集、ELISA酶標(biāo)儀）滴度表示第二十五張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體效價測定的方法第二十六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、雙層平板法第二十七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、雙層平板法37約4hr雙層平板法雙層平板法（1.5%瓊脂培養(yǎng)基10mL）雙層平板法宿主菌懸液（對數(shù)

9、期菌液0.9mL）噬菌體菌懸液（合適稀釋液0.1mL）上層培養(yǎng)基（0.8%瓊脂培養(yǎng)基5mL）混勻計數(shù)第二十八張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月單層與雙層平板法所形成的噬菌斑的比較第二十九張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月雙層平板法的優(yōu)點：加了底層培養(yǎng)基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補；所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此不僅每一噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象；因上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計數(shù)。 第三十張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月三、實驗原理一個噬菌體侵染宿主細(xì)胞引起裂解擴(kuò)散重復(fù)侵染裂解形成一個噬菌

10、斑（瓊脂凝膠中）宿主細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于噬菌體數(shù)？噬菌體效價（pfu/ml）= 噬菌斑數(shù)10稀釋倍數(shù)第三十一張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、實驗步驟1、制備底層平板 將已滅菌融化的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板6個（倒薄一些），凝固。2、加入大腸桿菌敏感菌 在每個牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，無菌條件下，各皿加入敏感菌菌懸液0.9mL。第三十二張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月3、稀釋噬菌體 取1mL含噬菌體液加入到 9mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，采用10倍稀釋法，分別制備噬菌體稀釋液（10-7、 10-8 、 10-9 ）。4、噬菌體與大腸桿菌敏感菌混合 將已加有大腸桿菌敏感菌6皿平板

11、（ 10-7 、 10-8 、 10-9各2皿）中，分別加入0.1mL噬菌體稀釋液，混合后放置5分鐘。第三十三張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月5、加入上層培養(yǎng)基 將5mL溶化的半固體培養(yǎng)基中迅速倒入含噬菌體與大腸桿菌敏感菌平板中（4550），并混合均勻。靜止凝固。6、培養(yǎng) 37培養(yǎng)5小時或室溫培養(yǎng)12小時。第三十四張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月7、觀察、計數(shù) 觀察平板中的噬菌斑，將每一稀釋度的噬菌斑形成單位（pfu）記錄于表格內(nèi)。8、計算噬菌體的效價 按照六個計數(shù)原則選擇，計算每毫升未稀釋的原液的噬菌體效價。噬菌體效價（pfu/ml）= 噬菌斑數(shù)10 稀釋倍數(shù)第三十五張，PP

12、T共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗步驟框圖（教師進(jìn)行演示操作）用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基倒平板6皿（薄一點） 噬菌體稀釋液（10-7、10-8、10-9）0.1mL，各2皿敏感菌菌懸液0.9mL放入已有底層固體培養(yǎng)基的平板中混勻放置5分鐘將5mL溶化的半固體培養(yǎng)基中倒入上述平板中（4550）混勻（動作？）37培養(yǎng)4小時或室溫培養(yǎng)12小時觀察結(jié)果計數(shù)第三十六張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月教科書介紹方法的操作步驟噬菌體稀釋液0.1ml宿主培養(yǎng)液0.9ml4548溶化好牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基4ml混勻吸附5min搓動混勻后倒于有底層的平板中鋪平37 培養(yǎng)56小時，觀察計數(shù)在無菌空試管中混勻上層后（3種成分），再倒入底層 上鋪平。第三十七張，PPT共四十頁，創(chuàng)作于2022年6月思考題噬菌體稀釋度10-710-810-9123平均123平均123平均pfu數(shù)/