重組子的篩選與鑒定課件

1、基 因 工 程 原 理Principles of Genetic Engineering山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程原理 目的基因基因載體重組子分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線1.重組率重組子（目的重組子）自我連接載體（非重組子）兩個(gè)相互連接的載體以及兩個(gè)基因片段插入的載體（非目的重組子）2. 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化菌中有一部分是重組子，還有非重組子。重組子中存在非目的重組子。轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。重組子的篩選與鑒定 山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張建勇基因工程原理“選擇”（sel

2、ection）和“篩選”（screening）的基本含義選擇，是指通過(guò)某種外來(lái)附加壓力（或因素）的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。包括根據(jù)克隆載體提供的表型特征的簡(jiǎn)單選擇，和根據(jù)突變的互補(bǔ)作用對(duì)克隆基因的直接選擇。篩選則是指通過(guò)某種特定的方法，從被分析的細(xì)胞群體或基因文庫(kù)中，鑒定出真正具有所需重組DNA分子的特定克隆的過(guò)程。 第七章 重組子的篩選與鑒定 一、 遺傳檢測(cè)法二、 物理檢測(cè)法三、 雜交檢測(cè)法四、 免疫化學(xué)檢測(cè)法確定外源DNA片段是否插入并與載體連接。一、 遺傳檢測(cè)法 1根據(jù)載體表型特征選擇重組體分子2根據(jù)插入序列表型特征選擇重組體分子1根據(jù)載體表型特征選擇重

3、組體分子載體分子，都帶有一個(gè)可選擇的遺傳標(biāo)記或表型特征。根據(jù)載體分子的遺傳特征進(jìn)行選擇，是獲得重組體DNA分子細(xì)胞群體的必不可少的條件之一。(1) 抗生素抗性基因插入失活選擇法 (2) -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 (1)抗生素抗性基因插入失活選擇檢測(cè)外源DNA插入作用的一種通用的方法是插人失活效應(yīng)(insertional inactivation)。適用于帶有抗生素抗性基因的克隆載體，將外源DNA插入到抗生素抗性基因序列內(nèi)，該基因就失活。設(shè)計(jì)一套含抗生素平板，可篩選出重組子。四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr) 等pBR322特點(diǎn)：多種抗藥標(biāo)記分子量低：4363bp高拷貝

4、多單酶切位點(diǎn)不影響復(fù)制（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：pBR322抗菌素標(biāo)記選擇產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸：選擇過(guò)程：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來(lái)； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基1.PBR322含Ampr和tetr，

5、具有Ampr和tetr表型。2.在tetr任何一個(gè)酶切點(diǎn)插入外源基因片斷，都會(huì)導(dǎo)致tetr失活。3.轉(zhuǎn)化插入外源基因的PBR322的菌液涂布于含Amp的平板上，存活者必定是轉(zhuǎn)化子。（Ampr）4.將存活菌復(fù)印在含tet的瓊脂板上，對(duì)照2個(gè)平板，凡在Amp平板上生長(zhǎng)而在tet平板上不生長(zhǎng)的菌落，必定是帶有外源基因的重組子。（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過(guò)程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。更小的分子量和更高的拷貝數(shù)-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)檢測(cè)重組體具有多克隆位點(diǎn)2686bp(2) -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子(2) -半乳糖苷酶顯

6、色反應(yīng)選擇法將pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)加有X-gal和乳糖誘導(dǎo)物IPTG的培養(yǎng)基中時(shí)，由于基因內(nèi)互補(bǔ)作用形成的有功能的半乳糖苷酶，會(huì)把培養(yǎng)基中無(wú)色的X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物5-溴-4-氯-靛藍(lán)(5-bromo-4-chloro-indigo)，使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色。 外源DNA插入到它的lac Z基因上所造成的-半乳糖苷酶失活效應(yīng)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的顏色為白色。-半乳糖苷酶法lacZAmN2H片段COOH片段-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）

7、的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。假陽(yáng)性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒(méi)有中止密碼（不破壞肽）。選擇過(guò)程白色菌落（重組子）藍(lán)色菌落（非重組子）藍(lán)色菌落（非重組子）-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。（3）溶菌選擇法DNA感染E.coli發(fā)生溶菌生長(zhǎng)，形成很亮的噬菌斑，溶源生長(zhǎng)多少也有溶菌，挑選噬菌斑即可分析鑒定轉(zhuǎn)化子。 2根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組體分子基本原理：轉(zhuǎn)化的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生

8、體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如，編碼大腸桿菌生物合成基因的克隆所具有的外源DNA片段，對(duì)于大腸桿菌寄主菌株的不可逆的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變具有互補(bǔ)的功能。根據(jù)這種特性，便可以分離到獲得了這種基因的重組體克隆。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。其原理是：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子 彌補(bǔ)缺陷常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記： 用于大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受

9、體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型 小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對(duì)三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長(zhǎng)例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。增加新性狀二 物理檢測(cè)法凝膠電泳檢測(cè)法 限制酶切檢測(cè)法R-環(huán)檢測(cè)法1.凝膠電泳檢測(cè)法重組體在相對(duì)分子質(zhì)量上會(huì)有所增加。分離質(zhì)粒DNA并測(cè)定其分子長(zhǎng)度是一種直截了當(dāng)?shù)姆椒?。通常用比較簡(jiǎn)單的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。 電泳法篩選比抗藥性插入失活平板篩選更進(jìn)了一步。有些假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落，如自我連接載體、缺失連接載體、未消化載體、兩個(gè)相互連接的載體以及兩個(gè)外源片段插入的載體等轉(zhuǎn)化的菌落，用平板篩選法不能鑒別，但可

10、以被電泳法淘汰。 利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。DNA電泳檢測(cè)法 分子量 Marker載體重組克隆如果插入片段是大小相近的非目的基因片段，對(duì)于這樣的陽(yáng)性重組體，電泳法仍不能鑒別，只有用Southern blotting雜交，即以目的基因片段制備放射性探針和電泳篩選出的重組體DNA雜交，才能最終確定真陽(yáng)性重組體。 （3）PCR擴(kuò)增檢測(cè)法原理：PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。過(guò)程：從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。用外源DNA插入片斷引物作PCR。電泳PCR產(chǎn)物。檢查是否有PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度

11、是否與外源基因一致。菌液PCR用EP管離心收集少許菌體（菌體的量無(wú)需太多），加入適量的滅菌水重懸，沸水10min，12000rpm離心5min，用上清做模板進(jìn)行PCR。94度變形可以裂解細(xì)菌，釋放出DNA，所以不用提質(zhì)粒也可以PCR出來(lái)?xiàng)l帶。菌液PCR假陽(yáng)性率高，建議在做過(guò)菌液PCR后，選取陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒PCR、酶切。2.限制酶切分析法限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法能區(qū)分重組子與非重組子，還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。酶切鑒定是必需的 1.限制性圖譜個(gè)體

12、特異性, 不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。 2.同一載體連接不同的DNA片段，不同的載體連接同一片段(片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的 。 3.插入法(單酶單切點(diǎn))或替代法(雙酶雙位點(diǎn))酶切 可鑒定載體及 插入片段的大小，方向，切后并電泳分析，以確定是否得到預(yù)期的重組DNA。若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因，可進(jìn)行序列測(cè)定。若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。EcoRIPBR325-APOAIPUC19-APOAI加樣孔2.7kb5.4kb0.89kbPUC19-APCAI和PBR325-APOAI質(zhì)粒PNA及其ECORI酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖PU

13、C19質(zhì)粒小量快速提取加酶切鑒定本法適用于:單酶單切點(diǎn)雙酶雙切點(diǎn) 重組DNA轉(zhuǎn)化菌落明顯多于(理論應(yīng)該多)載體對(duì)照組時(shí)首選。基本流程是:挑選平板轉(zhuǎn)化菌落小量培養(yǎng)快速提取質(zhì)粒。酶切DNA和載體對(duì)照電泳即可判斷所選菌落是否含有重組DNA分子。篩選過(guò)程3.R-環(huán)檢測(cè)法臨近雙鏈DNA變性溫度下和高濃度（70%）的甲酰胺溶液中，雙鏈的DNA-RNA分子要比雙鏈的DNA-DNA分子更為穩(wěn)定。因此，將RNA及DNA的，RNA便會(huì)同雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交分子，而另一鏈處于單鏈狀態(tài)。這種由單鏈DNA分支和雙鏈DNA-RNA分支形成的“泡狀”體，叫做R-環(huán)結(jié)構(gòu)。R-環(huán)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)

14、定，可以在電子顯微鏡下觀察到?？梢澡b定出雙鏈DNA中存在的與特定RNA分子同源的區(qū)域。 三 核酸雜交法帶有互補(bǔ)序列的DNA或RNA，其相應(yīng)的同源區(qū)段就會(huì)退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)；如果退火的核酸來(lái)自不同的有機(jī)體，形成的雙鏈分子就被稱為“雜種核酸分子”DNA/DNA雜交揭示親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。DNA/RNA雜交也可用來(lái)揭示核酸片段中特定基因的位置。核酸雜交通常采用一種帶上放射性同位素或熒光標(biāo)記的純的單鏈DNA或RNA作為探針（probe），從一個(gè)大的未知的DNA或RNA群體中篩選到與之互補(bǔ)的同源DNA或RNA序列。基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為D

15、NA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。 核酸探針的來(lái)源：目的基因的部分已克隆序列與目的基因同源性很高的已克隆的其它基因寡核苷酸探針（一）、核酸雜交流程通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。烘烤或紫外交聯(lián)法固定DNA片段附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補(bǔ)的每一條DNA帶的位置。X光底片曝光，得到放射自顯影圖片熒光標(biāo)記法（二）、雜交方法原位雜交斑點(diǎn)雜交Southern 印跡雜交 （Southern blotting ）Nort

16、hern 印跡雜交（Northern blotting ）Western 印跡雜交（Western blotting ）1.原位雜交原位雜交(insitu hybridization)亦稱菌落雜交或噬菌體雜交。這是因?yàn)樯L(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來(lái)的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。這種方法對(duì)于從成千上萬(wàn)的菌落或噬菌斑中鑒定出含有重組體分子的菌落或噬菌斑具有特殊的實(shí)用價(jià)值。 2.斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交（Dot blot）：是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。（1）DNA斑點(diǎn)雜交：先將膜在水中浸濕，再放到15SSC中。將

17、DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置,將DNA點(diǎn)樣于膜上,每個(gè)樣品一般點(diǎn)5l(210g DNA)。將膜烘干，密封保存?zhèn)溆?。?）RNA斑點(diǎn)雜交3.Southern 印跡雜交兩個(gè)步驟：核酸印記轉(zhuǎn)移濾膜與標(biāo)記的探針雜交膠上的DNA或RNA分子，必須通過(guò)毛細(xì)管或電導(dǎo)作用轉(zhuǎn)移到濾膜上。尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、二乙氨基乙基纖維素濾膜Southern blot 篩選結(jié)果Wet Electro Blotting Southern 印跡雜交的用途確定在克隆片段中基因編碼區(qū)的大小和位置確定克隆片段在基因組中的拷貝數(shù)4. Northern 印跡雜交（Northern blott

18、ing ）Northern雜交的總體過(guò)程與Southern 雜交相似，只不過(guò)在Blotting過(guò)程中轉(zhuǎn)移的是RNA 而不是DNA 。Northern雜交主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中是否存在與探針同源的mRNA分子，從而判斷在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達(dá)，通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱可比較基因表達(dá)的強(qiáng)弱。Northern blotting用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。通過(guò)表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選外源DNA引入宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此為抗原與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)不依賴于基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性,只要抗原決定序列能被正確表達(dá)外源DNA可以是

19、一個(gè)完整編碼區(qū)，也可能是一個(gè)外顯子，這些序列可以插入E.coli表達(dá)型載體 5. Western 印跡雜交（Western blotting ）Western雜交也與Southern雜交相似，只不過(guò)在Blotting過(guò)程中轉(zhuǎn)移的是蛋白質(zhì)而不是 DNA，這種將蛋白質(zhì)樣品從 SDS凝膠通過(guò)電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到濾膜的方法，稱為Western blotting。其后的雜交過(guò)程不是真實(shí)意義的分子雜交，而是通過(guò)抗體以免疫反應(yīng)形式檢測(cè)濾膜上是否存在被抗體識(shí)別的蛋白質(zhì)，并判斷其分子量。所用的探針不是DNA或RNA， 而是針對(duì)某一蛋白質(zhì)制備的特異性抗體。Western blotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的

20、方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。 Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白Western裝置 Blotting原理與ELISA相同。待測(cè)蛋白硝酸纖 維素膜一抗二抗辣根過(guò)氧 化物酶底物產(chǎn)物， 并發(fā)出光PAGE膠待測(cè)蛋白底片曝光辣根過(guò)氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。 Blotting過(guò)程Immuno Blotting結(jié)果多克隆抗體Blotting

21、的結(jié)果單抗blotting結(jié)果方法優(yōu)點(diǎn)弱點(diǎn)選擇順序1.-互補(bǔ)簡(jiǎn)潔而行試劑貴,受材料限制有錢(qián)首選2.質(zhì)?？焯岫盖需b方便易行費(fèi)時(shí)費(fèi)力無(wú)錢(qián)首選3.插入失活易行受材料局限可選4.雜交經(jīng)典靈敏放標(biāo)/非放標(biāo)可選4種方法選擇: 四 免疫化學(xué)檢測(cè)法及其它直接的免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，同菌落雜交技術(shù)在程度上是十分類似的。它是用抗體鑒定那引起產(chǎn)生外源DNA編碼的抗原的菌落或噬菌斑。只要當(dāng)一個(gè)克隆的目的基因，能夠在大腸桿菌寄生細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，合成出外源的蛋白質(zhì)，就可以采用免疫化學(xué)法檢測(cè)重組體克隆。免疫化學(xué)檢測(cè)法可分為放射性抗體測(cè)定法（radioactive antibody test），和免疫沉淀測(cè)定法（immunop

22、recipitation test）。這些方法最突出的優(yōu)點(diǎn)是，它們能夠檢測(cè)不為寄主提供任何可選擇的表型特征的克隆基因。 Antibody can be used as probesLigand（配體） can also be used as probes濾膜+利用抗體作為“探針”來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：1、放射性抗體檢測(cè)法抗體與產(chǎn)物的多種結(jié)合方式對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。蛋白蛋白“雜交” 待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測(cè)基

23、因 產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗放射性抗體檢測(cè)法過(guò)程把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”(白色圓圈)。a. 原理抗原抗體凝集反應(yīng)。檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。b. 方法2.免疫沉淀檢測(cè)法2.免疫沉淀檢測(cè)法菌落沉淀素對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。3. Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測(cè)法質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測(cè)融合蛋白。既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。固相支 持濾膜抗A抗體

24、125I標(biāo)記的 抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支 持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光4、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay（1）. 原理：一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗無(wú)色的底物有色的產(chǎn)

25、物比色觀察酶 19（2）. ELISA檢測(cè)的一般步驟固定樣品：將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎准尤胍豢?，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。一抗結(jié)合：一抗加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。二抗結(jié)合：二抗加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。顯色反應(yīng)在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。比色（3）.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。 必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclo

26、nal antibody）無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)5. 轉(zhuǎn)譯篩選法 能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。 如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。借助無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過(guò)表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。轉(zhuǎn)譯篩選mRNA無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的 甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性 帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？五 DNA-蛋白質(zhì)篩選法 DNA-蛋白質(zhì)篩選法是專門(mén)設(shè)計(jì)用來(lái)檢測(cè)同DNA特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子的一種方法?；静僮鞒绦蚴牵河孟跛崂w維素濾膜進(jìn)行“噬菌斑轉(zhuǎn)移”，使其

27、中的蛋白質(zhì)吸附在濾膜上；再將此濾膜同放射性同位素標(biāo)記的含有DNA結(jié)合蛋白質(zhì)編碼序列的雙鏈DNA寡核苷酸探針雜交；最后根據(jù)放射自顯影的結(jié)果篩選出陽(yáng)性反應(yīng)克隆。（1）凝膠阻滯試驗(yàn)DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(DNA mobility shift assay)，又叫凝膠阻滯試驗(yàn)，是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的凝膠電泳技術(shù)。例如：克隆啟動(dòng)子DNA片段并標(biāo)記，用該實(shí)驗(yàn)就可找到相應(yīng)的結(jié)合蛋白?；驹頌? 凝膠電泳時(shí)，DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽(yáng)極移動(dòng)的速度快，因此，可標(biāo)記短的雙鏈DNA片段，將其與蛋白質(zhì)混合，對(duì)混合物進(jìn)行凝膠電泳，若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，其向陽(yáng)極移動(dòng)的速度受到阻滯，對(duì)凝膠進(jìn)行放射性自顯影，就可找到DNA結(jié)合蛋白。（2）DNase I足跡試驗(yàn)試驗(yàn)原理： 蛋