蛋白質(zhì)工程的崛起

1、1.4蛋白質(zhì)工程的崛起一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由滿足人類生產(chǎn)和生活的需要例如：改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對生產(chǎn)和生活的需求。蛋白質(zhì)工程的概念基礎(chǔ):蛋白質(zhì)工程的實質(zhì)：途徑:目標(biāo):蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能基因修飾或基因合成 改

2、造或制造新的蛋白質(zhì)，滿足人類的生產(chǎn)或生活的需要是對編碼蛋白質(zhì)的基因進行改造又稱為第二代基因工程 注： 對基因進行改造的蛋白質(zhì)可使基因控制的性狀遺傳下去，而直接改造蛋白質(zhì)卻不能遺傳。蛋白質(zhì)工程的流程基因DNA氨基酸序列多肽鏈蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)期功能生物功能mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯折疊DNA合成分子設(shè)計蛋白質(zhì)工程原理天然蛋白質(zhì)的合成途徑：基因表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯）形成氨基酸序列的多肽鏈形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)行使生物功能預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列酸蛋白質(zhì)工程的途徑：蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測定其氨基酸序列；（

3、3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維結(jié)構(gòu)和三維晶體結(jié)構(gòu);（4）設(shè)計各種處理條件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對其活性與功能的影響；（5）設(shè)計編碼該蛋白的基因改造方案，如點突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測后投入實際使用。一級結(jié)構(gòu)：組成蛋白質(zhì)多肽鏈的線性氨基酸序列。二級結(jié)構(gòu)：依靠不同氨基酸之間的C=O和N-H基團間的氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要為螺旋和折疊。三級結(jié)構(gòu)：通過多個二級結(jié)構(gòu)元素在三維空間的排列所形成的一個蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)：用于描述由不同多肽鏈（亞基）間相互作用形成具有功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物分子。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

4、胰島素的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)血紅蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) 返回三、蛋白質(zhì)工程的進展和前景成功的例子不多，主要是因為蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能需要依賴于正確的空間結(jié)構(gòu)，而科學(xué)家目前對大多數(shù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)了解很少 .現(xiàn)狀：進展和前景：對某些藥物進行改造，使之成為速效藥品制作電子元件蛋白質(zhì)工程在實施中的對大難題：對大多數(shù)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的了解還很不清楚首先應(yīng)該根據(jù)密碼子推出mRNA序列，再根據(jù)堿基互補配對原則推出脫氧核苷酸序列。確定目的基因的堿基序列后，就可以根據(jù)人類的需要，從基因庫中獲取并改造它，或通過人工合成的方法得到它。 1、已知某多肽鏈的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸怎樣得出決定這一段

5、肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應(yīng)的堿基序列寫出來。 2、確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能獲得目的基因（DNA）？ 討 論基因工程是遵循中心法則，從DNAmRNA蛋白質(zhì)折疊產(chǎn)生功能，基本上是生產(chǎn)出自然界已有的蛋白質(zhì)。2、蛋白質(zhì)工程操作程序的基本思路與基因工程有什么不同？ 蛋白質(zhì)工程是按照以下思路進行的：確定蛋白質(zhì)的功能蛋白質(zhì)應(yīng)有的高級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)應(yīng)具備的折疊狀態(tài)應(yīng)有的氨基酸序列應(yīng)有的堿基排列，可以創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì) 。思考與探究1 關(guān)于生物體內(nèi)存在的天然蛋白質(zhì)，下列說法不正確的是（ ）A是生物在長期進化過程中形成的B它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要C構(gòu)成天然蛋白質(zhì)的氨基酸目前發(fā)現(xiàn)的有2

6、0種D一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要練習(xí) D2、以下關(guān)于蛋白質(zhì)工程的說法正確的是（）A、蛋白質(zhì)工程以基因工程為基礎(chǔ)B、蛋白質(zhì)工程就是酶工程的延伸C、蛋白質(zhì)工程就是用蛋白酶對蛋白質(zhì)進行改造D、蛋白質(zhì)工程只能生產(chǎn)天然的蛋白質(zhì) 2、蛋白質(zhì)工程的基本流程正確的是（）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)設(shè)計DNA合成預(yù)期蛋白質(zhì)功能根據(jù)氨基酸序列推出脫氧核苷酸序列A B C D4、蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，其結(jié)果產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是（）A氨基酸種類增多 B氨基酸種類減少C仍為天然存在蛋白質(zhì) D可合成天然不存在蛋白質(zhì)5、關(guān)于蛋白質(zhì)工程的進展和應(yīng)用，下列說法不正確的是（ ）A科學(xué)家通過對胰島素的改造，已使

7、其成為速效藥品B生物和材料科學(xué)家正積極探索將蛋白質(zhì)工程應(yīng)用于微電子方面C蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)非常成熟，目前正被大力推廣應(yīng)用D蛋白質(zhì)工程是一項難度很大的工程，目前成功的例子不多C鳥槍法(Shotgun) 將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的片段，分別連接到載體上，轉(zhuǎn)化受體細胞，形成一套重組克隆，篩選出含有目的基因期望重組子。鳥槍法局限性： 如同盲人打鳥而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%真核生物中目的基因中含有內(nèi)含子，真核生物中目的基因不能在原核細菌中表達。 （1）目的基因組DNA片段的制備。 如：機械切割，用超聲波處理，采用合適強度和時間。切割的DNA片段控制一定大小范

8、圍內(nèi)，上限是載體最大裝載量，下限應(yīng)大于目的基因長度。提取目的基因cDNA法：cDNA文庫（cDNA Bank） cDNA是與mRNA互補的DNA (Complementary DNA)，將供體生物細胞的mRNA分離出來，利用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成cDNA，克隆在受體細胞內(nèi)，篩選獲得含有目的基因編碼序列的重組克隆。優(yōu)點：（1）能選擇性克隆蛋白編碼基因，由mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA對特的基因而言只有一種可能性。（2）cDNA法克隆基因相當(dāng)“純凈”，不含5端調(diào)控區(qū)，剔除內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，有利于原核細胞的表達。（3）比相應(yīng)的基因組拷貝要小數(shù)十倍，2-3 Kb或更小，便于穩(wěn)定地克隆在表達型質(zhì)粒上。 發(fā)明PCR，公

9、司獎勵10,000美元獎金專利賣給Hoffmann-La Roche公司賣了3億美元Mullis得了1993年諾貝爾化學(xué)獎利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR擴增上億個拷貝（幾個小時），而癌癥細胞以高復(fù)制能力而著稱，完成同樣的多制工作一個癌癥細胞需要整整一個月?；瘜W(xué)合成法：前提a.如果目的基因的全序列是已知的，用化學(xué)合成法直接合成。b.DNA自動合成儀可合成不超過50個堿基寡聚核苷酸單鏈。c.用于核酸雜交的探針，分子克隆的人工接頭，PCR擴增的引物。d.由單鏈寡聚核苷酸通過退火直接裝備雙鏈DNA片段或基因?；蛭膸欤碚撋纤心骋簧锶旧w的所有DNA片段，包括基因編碼區(qū)和間隔區(qū)DNA。由鳥槍法

10、和cDNA法構(gòu)建。鳥槍法構(gòu)建的為基因組文庫 (Genomic Bank)。cDNA文庫,含有生物體的全套蛋白質(zhì)編碼序列,不含DNA調(diào)控序列從cDNA文庫篩選蛋白質(zhì)編碼基因，比從基因文庫篩選要簡捷。目的基因與運載體的結(jié)合表達載體的構(gòu)建目的基因啟動子和終止子標(biāo)記基因核糖體結(jié)合位點的強弱克隆基因的拷貝數(shù)所表達的蛋白質(zhì)的最終細胞定位翻譯的效率所表達的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，遺傳到下一代，同時使目的基因表達發(fā)揮作用。什么是強啟動子？與RNA聚合酶結(jié)合能力強,因此，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平高、頻繁持續(xù)強啟動子表達的弱點能量枯竭導(dǎo)致宿主細胞生長受阻質(zhì)粒容易丟失將目的基因?qū)胧荏w細胞目

11、的基因?qū)胛⑸锛毎杭毦D(zhuǎn)化五個步驟1）感受態(tài)的形成 感受態(tài)細胞能分泌一種小分子量的激活蛋白，感受因子，誘導(dǎo)特征性蛋白（細胞溶素）合成，使細胞壁部分溶解,暴露膜上DNA結(jié)合的蛋白。2）轉(zhuǎn)化因子結(jié)合 受體菌膜上的結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)特異結(jié)合。單鏈DNA,RNA,DNA-RNA雜合雙鏈都不能結(jié)合在膜上。3）轉(zhuǎn)化因子吸收 雙鏈DNA結(jié)構(gòu)與蛋白特異結(jié)合后，激活核酸酶，一條鏈被降解，另一條被吸受到受體菌中。4）整合復(fù)合物前體形成 整合復(fù)合物前體：進入受體細胞單鏈DNA與蛋白特異結(jié)合。保護單鏈DNA不被酶降解。5）轉(zhuǎn)化因子單鏈DNA整合 單鏈DNA通過同源重組，置換受體染色體同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。將目的基因?qū)胫参锛毎寥擂r(nóng)桿菌法基因槍法花粉管通道法1987年，周光宇中國的轉(zhuǎn)基因棉花