專利定稿可溶性型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備elisa試劑中的應(yīng)用及其試劑盒-返公司

1、接案號(hào)：140530101(與：140530102 和 140530103 同日申報(bào))(與：一案兩報(bào))專利申請(qǐng)著錄項(xiàng)目表請(qǐng)務(wù)必按照“注意事項(xiàng)”核對(duì)下述各欄是否填寫(xiě)正確特殊專利申請(qǐng)信息，涉及該項(xiàng)內(nèi)容時(shí)填寫(xiě)雙方及其它特殊要求同恒源知識(shí)2013帶格式的: 邊框:底端: (單實(shí)線, 自動(dòng)設(shè)置, 0.75 磅行寬)聯(lián)系人：電子郵箱：mshwang163 com人：轉(zhuǎn) 804；電子郵箱：其它特殊要求分案申請(qǐng)?jiān)暾?qǐng)?zhí)枺横槍?duì)的分案申請(qǐng)?zhí)枺涸暾?qǐng)日：年 月 日生物材料樣品保藏：地址：保藏日期：年 月 日保藏：分類(lèi)命名：在提交專利申請(qǐng)的同時(shí)提交生物材料樣品保藏及存活證明序列表本專利申請(qǐng)涉及核苷酸或氨基酸序列表11

2、 要求優(yōu)先權(quán)原受理機(jī)構(gòu)名稱：在先申請(qǐng)日：年 月 日在先申請(qǐng)?zhí)枺涸芾頇C(jī)構(gòu)名稱：在先申請(qǐng)日：年 月 日在先申請(qǐng)?zhí)枺?專利名稱可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應(yīng)用及其ELISA 試劑盒 專利類(lèi)型發(fā)明實(shí)用新型外觀設(shè)計(jì)一案兩報(bào) 所有發(fā)明人，大， 第一發(fā)明人國(guó)籍中國(guó)號(hào)申請(qǐng)人申請(qǐng)人 (1)或名稱組織機(jī)構(gòu)代碼/號(hào)450718925611130詳細(xì)地址省市溫江區(qū)惠民路 211 號(hào)申請(qǐng)人 (2)或名稱組織機(jī)構(gòu)代碼/號(hào)詳細(xì)地址申請(qǐng)人 (3)或名稱組織機(jī)構(gòu)代碼/號(hào)詳細(xì)地址提前請(qǐng)求提前該專利申請(qǐng)（只適用于發(fā)明專利申請(qǐng)）實(shí)質(zhì)在提交專利申請(qǐng)的同時(shí)提交實(shí)質(zhì)請(qǐng)求（只適用于發(fā)明專利申請(qǐng)）帶格式的: 邊框:底

3、端: (單實(shí)線, 自動(dòng)設(shè)置,行寬)0.75 磅一、本表由人預(yù)先填寫(xiě)，請(qǐng)聯(lián)系人仔細(xì)核對(duì)信息是否正確，若有錯(cuò)誤或缺漏請(qǐng)修改或補(bǔ)充。二、本表第欄，專利名稱包括字母、數(shù)字和標(biāo)點(diǎn)符號(hào)在內(nèi)一般不得超過(guò) 25 個(gè)字，化學(xué)領(lǐng)域可允許最多到 40 個(gè)字。三、本表第欄，專利類(lèi)型分為發(fā)明、實(shí)用新型和外觀設(shè)計(jì)三種。對(duì)產(chǎn)品、方法或者其改進(jìn)所新的技術(shù)方案可以申請(qǐng)發(fā)明專利。對(duì)產(chǎn)品的形狀、構(gòu)造或者其結(jié)合所適于實(shí)用的新的技術(shù)方案可以申請(qǐng)實(shí)用新型專利。對(duì)產(chǎn)品的形狀、圖案或者其結(jié)合以及色彩與形狀、圖案的結(jié)合所作出的富有美感并適于工業(yè)應(yīng)用的新設(shè)計(jì)可以申請(qǐng)外觀設(shè)計(jì)專利。申請(qǐng)人可以同日對(duì)同樣的發(fā)明創(chuàng)造既申請(qǐng)實(shí)用新型專利又申請(qǐng)發(fā)明專利（簡(jiǎn)

4、稱一案兩報(bào)）。四、本表第欄，發(fā)明人是指對(duì)發(fā)明創(chuàng)造的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)作出創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的人。發(fā)明人應(yīng)當(dāng)是個(gè)人。發(fā)明人應(yīng)當(dāng)使用中文；外國(guó)發(fā)明人的中譯名可以使用外文縮寫(xiě)字母，姓和名之間用圓點(diǎn)分開(kāi)，例如M 。發(fā)明人有兩個(gè)以上的應(yīng)當(dāng)自左向右順序填寫(xiě)。發(fā)明人可以請(qǐng)求國(guó)家知識(shí)局不其，若請(qǐng)求不，應(yīng)當(dāng)在此欄所填寫(xiě)的相應(yīng)發(fā)明人后面注明“（不）”。五、本表第欄，第一發(fā)明人、臺(tái)地區(qū)的，其國(guó)籍應(yīng)填寫(xiě)為“中國(guó)”。第一發(fā)明人為中國(guó)內(nèi)地居民的，還應(yīng)當(dāng)同時(shí)填寫(xiě)居民件號(hào)碼（或軍官證號(hào)碼）。六、本表第欄，申請(qǐng)人是指提出專利申請(qǐng)的人。除另有協(xié)議外，職務(wù)發(fā)明的申請(qǐng)人為，非職務(wù)發(fā)明的申請(qǐng)人為個(gè)人。申請(qǐng)人可以有多個(gè)，如兩個(gè)或兩個(gè)以上的、一個(gè)和一個(gè)個(gè)

5、人等等。申請(qǐng)人是的，應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)正式全稱、組織機(jī)構(gòu)代碼、地址和；申請(qǐng)人是個(gè)人的，應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)本人真實(shí)、居民件號(hào)碼（或軍官證號(hào)碼）、地址和。地址欄應(yīng)明確至街道門(mén)牌號(hào)碼。七、本表第欄，提前是指在發(fā)明專利申請(qǐng)初步合格后立即進(jìn)入準(zhǔn)備。如果不請(qǐng)求提前，則該發(fā)明專利申請(qǐng)將在自申請(qǐng)日起滿十八個(gè)月時(shí)。由于發(fā)明專利申請(qǐng)必須在以后才能進(jìn)入實(shí)質(zhì)程序，為了加快申請(qǐng)的進(jìn)程，在申請(qǐng)人無(wú)特別要求的情況下，本公司默認(rèn)勾選此欄。如申請(qǐng)人不要求提前，請(qǐng)去除勾選并及時(shí)通知人。八、本表第欄，實(shí)質(zhì)是指員對(duì)發(fā)明專利申請(qǐng)是否符合條件（包括新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性、公開(kāi)充分、單一性問(wèn)題等）進(jìn)行。申請(qǐng)人可以在自申請(qǐng)日（有優(yōu)先權(quán)的，指優(yōu)先權(quán)日）起三年內(nèi)提

6、出實(shí)質(zhì)請(qǐng)求來(lái)啟動(dòng)實(shí)質(zhì)程序。如果在提交專利申請(qǐng)的同時(shí)提交實(shí)質(zhì)請(qǐng)求，則該發(fā)明專利申請(qǐng)?jiān)诤罅⒓催M(jìn)入實(shí)質(zhì)階段。為了加快發(fā)明專利申請(qǐng)的進(jìn)程，在申請(qǐng)人無(wú)特別要求的情況下，本公司默認(rèn)勾選此欄。如申請(qǐng)人不想在提交專利申請(qǐng)的同時(shí)提交實(shí)質(zhì)理人。請(qǐng)求，請(qǐng)去除勾選并及時(shí)通知代九、本表第欄，申請(qǐng)是分案申請(qǐng)的，應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)此欄。一件專利申請(qǐng)中包含兩項(xiàng)以上發(fā)明、實(shí)用新型或者外觀設(shè)計(jì)的，在該專利申請(qǐng)未結(jié)案之前，申請(qǐng)人可以基于該專利申請(qǐng)主動(dòng)提出或者依據(jù)員的意見(jiàn)提出一件或多件分案申請(qǐng)。分案申請(qǐng)的類(lèi)別應(yīng)當(dāng)與原申請(qǐng)的類(lèi)別一致。分案申請(qǐng)應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)原申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)柡蜕暾?qǐng)日；對(duì)于已提出過(guò)分案申請(qǐng)，申請(qǐng)人需要針對(duì)該分案申請(qǐng)?jiān)俅翁岢龇职干暾?qǐng)的，還應(yīng)當(dāng)

7、填寫(xiě)該分案申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)?。十、本表第欄，發(fā)明專利申請(qǐng)涉及公眾不能得到的生物材料的，應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)此欄，并自申請(qǐng)日起四個(gè)月內(nèi)提交由保藏出具的該生物材料樣品的保藏及存活證明。專利定，如果申請(qǐng)涉及的完成發(fā)明必帶格式的: 左帶格式的: 邊框:底端: (單實(shí)線, 自動(dòng)設(shè)置, 0.75 磅行寬)須使用的生物材料是公眾不能得到的，申請(qǐng)人必須在申請(qǐng)日前或者最遲在申請(qǐng)日（有優(yōu)先權(quán)的，指優(yōu)先權(quán)日）當(dāng)天將該生物材料樣品提交至國(guó)家知識(shí)局認(rèn)可的生物材料樣品國(guó)際保藏保藏。十一、本表第欄，發(fā)明專利申請(qǐng)涉及核苷酸或氨基酸序列表的，應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)此欄，并在提交專利申請(qǐng)文件的同時(shí)提交核苷酸或氨基酸序列表的計(jì)算機(jī)可讀形式副本。十二、本表第11

8、欄，申請(qǐng)人要求外國(guó)或者本國(guó)優(yōu)先權(quán)的，應(yīng)當(dāng)填寫(xiě)此欄。專利定，申請(qǐng)人就相同的發(fā)明或者實(shí)用新型在外國(guó)第一次提出專利申請(qǐng)之日起十二個(gè)月內(nèi)，或者就相同的外觀設(shè)計(jì)在外國(guó)第一次提出專利申請(qǐng)之日起六個(gè)月內(nèi)，又提出專利申請(qǐng)的，可以根據(jù)有關(guān)規(guī)定要求外國(guó)優(yōu)先權(quán)。申請(qǐng)人就相同的發(fā)明或者實(shí)用新型第一次提出專利申請(qǐng)之日起十二個(gè)月內(nèi)，又以該專利申請(qǐng)為基礎(chǔ)向?qū)＠痔岢霭l(fā)明或者實(shí)用新型專利申請(qǐng)的，可以要求本國(guó)優(yōu)先權(quán)。要求外國(guó)或者本國(guó)優(yōu)先權(quán)的在后申請(qǐng)以第一次專利申請(qǐng)的申請(qǐng)日作為優(yōu)先權(quán)日。申請(qǐng)人在一件專利申請(qǐng)中，可以要求一項(xiàng)或多項(xiàng)優(yōu)先權(quán)。帶格式的: 左 摘 要本發(fā)明公開(kāi)了可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應(yīng)用及其E

9、LISA 試的反應(yīng)板、酶標(biāo)抗體、顯色液和劑盒，ELISA 試劑盒含有可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白終止液，將該試劑盒用于檢測(cè) I 型鴨性肝炎抗體具有特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、敏感度高，與用全作抗原的ELISA 試劑盒檢測(cè)的符合率高，可用于臨床樣品的檢測(cè)。1摘 要 附 圖1權(quán) 利 要 求 書(shū)1、 可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白在檢測(cè)I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述可溶性蛋白的步驟如下：將SEQ ID NO.3 所示序列的第 91376位核苷酸連接于 pET-32(a)+載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，然后以大腸桿菌 Rosetta、BL21 或BL21(DE3)PLYS 為宿主菌，在

10、抗性的 LB 培養(yǎng)基中活化后，在 IPTG 終濃度為 0.21.0mmol/L、溫度為 2039條件下誘導(dǎo)表達(dá) 412 小時(shí)，收集菌液，離心后收集菌體，將收集的菌體用 20 mmol/L、為 8.0 的Tris-HCl 懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進(jìn)行離心，上清用 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化，透析，超濾得可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白。2、 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的應(yīng)用，其特征在于：所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS。3、 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的應(yīng)用，其特征在于：所述誘導(dǎo)表達(dá)為加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，在溫度為 25條件下誘導(dǎo)表達(dá) 6 小時(shí)。4、 根據(jù)

11、權(quán)利要求 1 所述的應(yīng)用，其特征在于，所述活化的具體步驟為：將表達(dá)菌株接種于抗性的 LB 培養(yǎng)基中，在 37、120 r/min 條件下過(guò)夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與性的LB 培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴(kuò)大培養(yǎng)至 OD600 為 0.6 即可。5、 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的應(yīng)用，其特征在于：所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎6 次，30sec/次，每次間隔 30sec。6、 檢測(cè)I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有可溶性I抗型鴨肝炎3D 蛋白7、 根據(jù)權(quán)利要求 6的反應(yīng)板。所述的 ELISA 試劑盒，其特征在于：所述反應(yīng)板的方法為將1g/mL 的可溶性 I 型鴨肝

12、炎PBST 洗板 5 次，拍干即可。3D 蛋白按每孔 100L 加入反應(yīng)板中， 4過(guò)夜，次日8、 根據(jù)權(quán)利要求 6 所述的 ELISA 試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還含有酶標(biāo)抗體、顯色液和終止液。9、 根據(jù)權(quán)利要求 6 所述的ELISA 試劑盒，其特征在于：所述酶標(biāo)抗體為 HRP 標(biāo)記羊抗鴨IgG 或HRP 標(biāo)記兔抗鴨IgG，所述顯色液為 TMB，所述終止液為濃度為 2 mol/L 的H2SO4。1可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應(yīng)用及其 ELISA 試劑盒技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在ELISA 試劑中的應(yīng)用和檢測(cè)I 型鴨背景技

13、術(shù)性肝炎抗體的 ELISA 試劑盒。我國(guó)是世界上養(yǎng)鴨數(shù)量最多的國(guó)家，鴨的飼養(yǎng)量約占世界的 70%，養(yǎng)鴨業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。鴨肝炎（Duck Hepatitis，DHV）可引起的鴨性肝炎（Duck Viral Hepatitis，DVH）。DVH 是一種高度致死性傳染病，以發(fā)病急、病程短、發(fā)病率和率高為特點(diǎn)。鴨肝炎屬于小 RNA科（Picornaviridae）禽肝炎屬（Avihepato），本病毒有三個(gè)型，分別為 DHAV-1、DHAV-2 和 DHAV-3，無(wú)免疫交叉反應(yīng)。在我國(guó)，主要流行 1 型鴨性肝炎，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。因此對(duì) DHAV 等

14、鴨源進(jìn)行研究具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。對(duì)鴨肝炎及鴨肝炎進(jìn)行研究，離不開(kāi)鴨肝炎及其抗體的檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法?？捎糜?DHV 及其抗體檢測(cè)的試劑及方法雖很多，如血凝實(shí)驗(yàn)、協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散、ELISA、熒光抗體、免疫組化、膠體金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和試驗(yàn) ，但因其操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、成本高，不能用于快速檢測(cè)因而不適于基層推廣應(yīng)用。ELISA法具有操作簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。早在 1991 年，Zhao 等運(yùn)用中和實(shí)驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA 法對(duì) DHV 抗體進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出率分別為 18.8%、68.8%和 68.8%；作為等以氯仿去脂、0.22

15、m 孔徑濾膜過(guò)濾、凝濃縮層析方法純化得到的抗原，也建立了檢測(cè) DHV抗體的間接 ELISA 方法。但該方法在具體使用中受到限制，一致未能推廣，其主要原因之一是檢測(cè) DHV抗體的間接 ELISA 方法對(duì)抗原純度要求很高，但由于必須依靠宿主細(xì)胞才能增殖，因此進(jìn)行全抗原純化時(shí)難于與宿主蛋白分離。隨著對(duì) DHAV-1 分子生物學(xué)研究的不斷深入，將重組表達(dá)蛋白（特別是大腸桿菌原核表達(dá)蛋白）抗原運(yùn)用到鴨肝炎抗體的檢測(cè)中成為可能。大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白抗原易于和純化，且表達(dá)重組蛋白抗原的宿主細(xì)胞大腸桿菌比DHV 抗原的宿主細(xì)胞（如鴨1胚及鴨源細(xì)胞、雞胚等）與 DHV 的宿主（鴨）親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，檢測(cè)時(shí)由于抗原

16、純度而產(chǎn)生非特異性的可能性也減少。但重組表達(dá)的蛋白抗原運(yùn)用到鴨肝炎抗體的檢測(cè)還有一個(gè)困難，就是大腸桿菌表達(dá)易形成不溶性的包涵體，包涵體由于雜蛋白含量較低、可避免蛋白酶降解、難溶于水等特點(diǎn)而使其易于分離純化。包涵體中的目標(biāo)蛋白雖然其肽鏈?zhǔn)峭暾模珔s是非天然形式、無(wú)生物學(xué)活性的表達(dá)蛋白，包涵體的溶解非常，需要用強(qiáng)變性劑高濃度尿素、SDS 等來(lái)打斷分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)鍵、離子鍵等，為獲得有活性的蛋白，繼而需要進(jìn)行蛋白復(fù)性，而包涵體蛋白溶解后的復(fù)性不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且復(fù)性率低。DHAV 具有微RNA科成員相似的特點(diǎn)，為單股正鏈RNA，完整組長(zhǎng)度約為7.7kb，由 5非翻譯區(qū)、一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（OR

17、F）、3非翻譯區(qū)組成，ORF 含有 6750nt，編碼2249AA 的多聚蛋白，隨后被編碼的蛋白酶切割，首先分解成 P1、P2 和 P3 產(chǎn)物，然后P1、P2 和P（3 P1 編碼結(jié)構(gòu)蛋白、P2 和P3 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白）又進(jìn)一步分別分解為VP0/VP1/VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C 和 3A/3B/3C/3D 蛋白，產(chǎn)生 12 個(gè)成蛋白。3D 是 DHAV 的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，雖然不是粒子的組成成分，但在生命循環(huán)中扮演著重要角色，在負(fù)鏈 RNA、酶過(guò)程中占有主導(dǎo)的作用，加之其本身的酶催化活性，使得 3D 蛋白在的生存過(guò)程中必不可少，因此，在機(jī)體內(nèi)可能產(chǎn)生 3D 抗體，但目前未見(jiàn) 3

18、D 蛋白是否可以作為抗原檢測(cè) DHAV 抗體的 ELISA 方法；同時(shí)，獲得高純度有活性的抗原并應(yīng)用于ELISA 檢測(cè)試劑盒 ，對(duì)于鴨性肝炎抗體的檢測(cè)的有重要的意義和推動(dòng)作用。發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在檢測(cè)I 型鴨性肝炎抗體ELISA 試劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供檢測(cè)I 型鴨體ELISA 試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：性肝炎抗1、可溶性 I 型鴨肝炎應(yīng)用，所述可溶性蛋白的3D 蛋白在檢測(cè) I 型鴨性肝炎抗體的 ELISA 試劑中的步驟如下：將SEQ ID NO.3 所示序列的第 91376 位核苷酸連接于pET-3

19、2(a)+載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，然后以大腸桿菌Rosetta、BL21 或 BL21(DE3)PLYS為宿主菌，在 抗性的 LB 培養(yǎng)基中活化后，在 IPTG 終濃度為 0.21.0 mmol/L、溫度為 2039條件下誘導(dǎo)表達(dá) 412 小時(shí)，收集菌液，離心后收集菌體，將收集的菌體用 20 mmol/L、為 8.0 的 Tris-HCl 懸浮，然后在冰浴下超聲，破碎后進(jìn)行離心，上清用 Ni2+-NTA 瓊脂糖2凝純化，透析，超濾得可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白。優(yōu)選的，所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS。優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)表達(dá)為加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，在溫度

20、為 25條件下誘導(dǎo)表達(dá) 6 小時(shí)。優(yōu)選的，所述活化的具體步驟為：將表達(dá)菌株接種于抗性的 LB 培養(yǎng)基中，在 37、120 r/min 條件下過(guò)夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與培養(yǎng)至 OD600 為 0.6 即可?？剐缘腖B 培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴(kuò)大更優(yōu)選的，所述冰浴下超聲為在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次間隔 30sec。2、檢測(cè)I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒，所述試劑盒含有可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白的反應(yīng)板。優(yōu)選的，所述反應(yīng)板的方法為將 1g/mL 的可溶性 I 型鴨肝炎，次日PBST 洗板 5 次，拍干即可。3D 蛋白按每孔100L 加入反應(yīng)板中，4過(guò)夜優(yōu)選的，

21、所述試劑盒還含有酶標(biāo)抗體、顯色液和終止液。更優(yōu)選的，所述酶標(biāo)抗體為 HRP 標(biāo)記羊抗鴨IgG 或HRP 標(biāo)記兔抗鴨IgG，所述顯色液為T(mén)MB，所述終止液為濃度為 2 mol/L 的 H2SO4。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開(kāi)了可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白在檢測(cè) I 型鴨性肝炎抗體ELISA 試劑中的應(yīng)用，且將其構(gòu)建為檢測(cè)試劑盒，獲得的試劑盒具有特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、敏感度高，與用全作抗原的ELISA 試劑盒檢測(cè)的符合率高，對(duì)I 型鴨性肝炎的具有重要意義。附圖說(shuō)明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：圖 1 為 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DPCR 擴(kuò)增產(chǎn)

22、物電泳結(jié)果（M：DL 2000Marker，1：3DPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物）。圖 2 為I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3D載體構(gòu)建過(guò)程中PCR 鑒定和酶切鑒定結(jié)果（A：pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1：PCR 產(chǎn)物；B： pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒酶切鑒定，M：DL15000 Marker，1：Kpn/Xho雙酶切條帶，2： Xho單酶切條帶；C：pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1： PCR 產(chǎn)物；D：pET32a+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的酶切鑒定，1：

23、Kpn/Xho雙酶切結(jié)果，2：Xho單酶切條帶）。3圖 3 為可溶性 3D 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化（M 為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；A：表達(dá)菌的篩選，1 為 pET-32(a)+空載體表達(dá)產(chǎn)物，2-4 分別為 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosetta、BL21 和 BL21(DE3)PLYS 三種不同表達(dá)宿主菌的表達(dá)產(chǎn)物；B：誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化，1-5 依次為誘導(dǎo) 12 h、10 h、8 h、6 h 和 4 h 的BL21(DE3)PLYS 宿主菌表達(dá)產(chǎn)物；C：誘導(dǎo)表達(dá)溫度的優(yōu)化，1-6 分別為 39、37、35、30、25和 20的 BL21(DE3)PLYS宿主菌表達(dá)

24、產(chǎn)物；D：IPTG 濃度優(yōu)化，1-5 分別為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物。圖 4 為 3D 蛋白 Western-blot 檢測(cè)及純化蛋白電泳（A 為 3D 蛋白的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果，M 為蛋白質(zhì) Marker，1 為 3D 蛋白印跡。B 為SDS檢測(cè)純化的 3D 蛋白，M 為低分子量蛋白質(zhì)Marker，1 為純化的 3D 蛋白）。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J. 薩

25、姆等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例 1、克隆 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DI 型鴨肝炎載體均由株 H（DHAV-H）（GenB：JQ301467）、E. coli DH5 菌種和pET-32(a)+禽病防治保存并提供。各種分子生物學(xué)試劑購(gòu)于生物試劑公司。根據(jù)DHAV-H 的物如下：組序列（GenB：JQ301467）設(shè)計(jì)擴(kuò)增 3D的引物，具體引P1：5-ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3（SEQ ID NO.1），下劃線表示 Kpn酶切位點(diǎn)；P2：5-acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3（SEQ I

26、D NO.2），下劃線表示 Xho酶切位點(diǎn)；然后將設(shè)計(jì)的引物由寶生物工程（大連）。取保存的 DHAV-H液以滅菌 PBS 作 5 倍稀釋，添加 1/100 體積的雙抗（青霉素、鏈霉素的終濃度分別為 100IU/mL 和 100g/mL）后于 37 溫育 1 h，然后接種 9 日齡發(fā)育良好、無(wú)母源抗體的鴨胚，棄去 24 h 內(nèi)胚，收集 2472 h胚的尿囊液及胚體，按照Trizol 試劑盒提取RNA。將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄4和PCR 擴(kuò)增體系如表 1 所示。表 1 反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)體系反錄轉(zhuǎn)程序?yàn)椋?0 10 min，42 15 m

27、in，95 5 min，4 5 min，循環(huán)一次；PCR程序?yàn)椋?4預(yù)變性 5 min；94變性 40 sec，56退火 40 sec，72后延伸 30 sec，30 個(gè)循環(huán)，最后 72后延伸 10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約 1386bp 的片段（不包括內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)性堿基則為 1368bp），其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，與預(yù)期片段大小相同，因此按照天根生化科技()的膠回收試劑盒回收目的條帶，回收獲得的片段命名為DHAV-H-3D。實(shí)施例 2、構(gòu)建表達(dá) I 型鴨肝炎株 H 3D 蛋白的表達(dá)載體將回收的 DHAV

28、-H-3D 與 pJET1.2 載體連接，連接反應(yīng)參照 pJET1.2 克隆試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系如表 2 所示。表 2、連接DHAV-H-3D 與pJET1.2 載體項(xiàng)目體積2Reaction Buffer DHAV-H-3D 回收產(chǎn)物 pJET1.2 載體水（nuclease free） T4 DNA-ligase小計(jì)10 L1 L1 L7 L1 L20 L按表 2 體系混合后進(jìn)行瞬時(shí)離心，然后在 20條件下連接 15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5感受態(tài)細(xì)胞，并用抗性的 LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，并將篩選菌落用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示序列為引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，

29、擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 中 A 所示。結(jié)果顯示，篩選獲得了陽(yáng)性克隆。為了進(jìn)一步檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆的菌株提取質(zhì)粒，然后經(jīng) Kpn和 Xho雙酶切5RTPCR5*PrimescriptTM Buffer2 LPrimescript RTase Mix0.5 L下游引物 P21 LRNA2 LRNAase Free 水4.5 L小計(jì)10 L2*Prime Star Mix12 5 L上游引物 P1（10pmol/L）1 L下游引物 P2（10pmol/L）1 LcDNA1 L滅菌蒸餾水9 5 L小計(jì)25 L及 Xho單酶切鑒定，酶切體系如表 3 所示。表 3、Kpn及 Xho酶

30、切鑒定反應(yīng)體系單酶切體系雙酶切體系10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L11.5 L/ 1 L25 L10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L10.5 L 1 L 1 L25 L滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水Kpn Xho小計(jì)Kpn Xho小計(jì)按表 3 體系混合后瞬時(shí)離心，然后于 37條件水浴 3 h，反應(yīng)結(jié)束將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖 2 中B。結(jié)果顯示，DHAV-H-3D 片段正確連入pJET1.2 載體中，并命名為 pJET-1.2+/DHAV-H-3D。將 pJET-1.2+/DHAV-H-3D 送 Invitrogen 公司篩選未突變的序列用于構(gòu)建表達(dá)載體。，取正確的

31、pJET-1.2+/DHAV-H-3D 和pET-32(a)+載體分別用 Kpn和 Xho進(jìn)行雙酶切，回收 3D及載體骨架，然后按表 4 所示體系進(jìn)行連接。表 4、3D及載體骨架連接體系項(xiàng)目體積5.5 L 2 L7.5 L15 L目的pET32a+回收液2Ligation mix小計(jì)按表 4 體系混合后瞬時(shí)離心，然后于 16條件下過(guò)夜連接，得 pET-32(a)+/DHAV-H-3D質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 宿主菌，以抗性LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，然后進(jìn)行 PCR鑒定，結(jié)果如圖 2 中 C 所示。然后將 PCR 鑒定為陽(yáng)性的菌株用于提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒用Xho進(jìn)行單酶切及用 Kpn和 Xho

32、進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 2 中 D 所示。由圖 2 中C 和D 可知，3D及載體骨架正確連接。實(shí)施例 3、I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的表達(dá)表達(dá)宿主菌大腸桿菌（ Escherichia coli ） Rosetta 、大腸桿菌 BL21 和大腸桿菌BL21(DE3)PLYS 菌種均由禽病防治保存；含 I 型鴨肝炎株H 3D蛋白的表達(dá)載體 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 由實(shí)施例 2 中構(gòu)建；各種分子生物學(xué)試劑購(gòu)于生6物試劑公司。將實(shí)施例 2 獲得的 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 BL21 、 Rosetta 和BL21(D

33、E3)PLYS 表達(dá)菌，轉(zhuǎn)化菌于過(guò)夜培養(yǎng)，次日將過(guò)夜培養(yǎng)物與新鮮抗性的LB 液體培養(yǎng)基中 37、120 r/min 條件下抗性的 LB 液體培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴(kuò)大培養(yǎng)約 3 小時(shí)，菌液 OD600 達(dá) 0.6 時(shí)加入 IPTG 至終濃度為 0.2mmol/L，并在 37下誘導(dǎo)12 h，然后收集菌液，將菌液在 12000 r/min 條件下、離心 10 min，菌體用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）按 1:10（V/V）懸浮。同時(shí)以 pET-32(a)+載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)表達(dá)菌作為對(duì)照。為了篩選表達(dá)出可溶性 3D 蛋白的表達(dá)菌，然后將上述制得的懸浮菌液在冰浴條件下超聲破碎

34、6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后的菌液在 4、12000r/min條件下離心 10min，棄沉淀（為不溶性包涵體表達(dá)蛋白），收集上清（為可溶性表達(dá)蛋白）。吸取 80L 上清，加入 20L 含-巰基乙醇的 5SDS 上樣buffer，煮沸 10min 后在 12000r/min條件下常溫離心 5min，然后進(jìn)行SDS電泳檢查，結(jié)果如圖 3 中A 所示。結(jié)果顯示，通過(guò)將重組質(zhì)粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 轉(zhuǎn)化到三種表達(dá)菌后，在約 68 kD 處出現(xiàn)了目的條帶，而對(duì)照不含有此條帶，并且轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)PLYS 菌株的蛋白表達(dá)量最大、BL21的表達(dá)

35、量次之，所以根據(jù)表達(dá)量篩選出最佳表達(dá)菌為BL21(DE3)PLYS。I 型鴨肝炎株H 可溶性 3D 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化：（1）IPTG 濃度的優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6左右，加入 IPTG 至終濃度分別為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L，然后在 37條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 h，然后用SDS檢測(cè)可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖 3 中 B

36、 所示。結(jié)果顯示，IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L條件下可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量最高，即IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L 為最適濃度。（2）誘導(dǎo)表達(dá)溫度優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 6抗性的LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后分別于溫度為 20、 25、30、35、37和 39條件下誘導(dǎo) 12 h，然后用SDS檢測(cè)可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖 3 中 C 所示。結(jié)果顯示，溫度在

37、 25條件下可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量最高，即誘導(dǎo)溫度為 25為最適表達(dá)溫度。（3）誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 377振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后于溫度為 25條件下誘導(dǎo) 4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h，然后用 SDS檢測(cè)可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖 3 中 D 所示。結(jié)果顯示，溫度在誘導(dǎo)表達(dá) 6h 后可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量以達(dá)到最高，即誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間

38、為 6h。經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化，可以看出含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌最優(yōu)表達(dá)條件為 0.8 mmol/L IPTG、25 誘導(dǎo) 6 h。后續(xù)按照此條件對(duì) 3D 蛋白進(jìn)行大量表達(dá)。I 型鴨肝炎株H 可溶性 3D 蛋白Western-blot 檢測(cè)，具體步驟如下：按最優(yōu)表達(dá)條件表達(dá)可溶性 3D 蛋白，然后進(jìn)行 SDS，隨后將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，80 V 轉(zhuǎn)印 90 min，轉(zhuǎn)印完畢后將 PVDF 膜取出，以 1% BSA 于 37 搖動(dòng)孵育 1 h，然后以1:100 稀釋的抗DHAV 的IgG 在 37搖動(dòng)孵育 1 h 后取出，以

39、TBS 洗滌 3 次，每次 2 min，隨后以 1:3000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鴨IgG 或HRP 標(biāo)記兔抗鴨IgG 于 37搖動(dòng)孵育 1 h，以 TBS 洗滌后按照 DAB 顯色試劑盒顯色，待目的條帶清晰可見(jiàn)時(shí)以蒸餾水沖洗終止顯色，結(jié)果如圖 4 中 A 所示，最后將PVDF 膜干燥避光保存。I 型鴨肝炎株H 可溶性 3D 蛋白的純化：將含重組質(zhì)粒pET-32(a)+/DHAV-H-3D 的BL21(DE3)PLYS 在最適條件下表達(dá)，然后收集菌體，用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）懸浮后在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后

40、的菌液在 4、12000r/min 條件下離心 10min，收集上清（為可溶性表達(dá)蛋白）；然后將收集的上清在 Bio-rad公司提供的 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化（純化液及純化方法按試劑盒進(jìn)行），將收集的純化蛋白液進(jìn)行透析后用 0.45m 的濾膜超濾，最后置于 4 、-20、-70或凍干保存。將純化后的可溶性 3D 蛋白進(jìn)行 SDS電泳，結(jié)果如圖 4 中 B 所示。結(jié)果顯示表達(dá)的 3D 蛋白經(jīng) Ni2+-NTA 親和純化后，得到了純度、濃度均較高的蛋白，經(jīng)核酸蛋白分析儀測(cè)定蛋白濃度為 1.5 mg/mL。實(shí)施例 4、利用可溶性 3D 蛋白以 ELISA 方法檢測(cè) I 型鴨性肝炎抗體ELIS

41、A 方法檢測(cè)I 型鴨性肝炎抗體的具體步驟如下：（1）抗原反應(yīng)板：加入實(shí)施例 3 純化獲得的可溶性 3D 蛋白，100 L/孔，次日PBST 洗板 5 次，每次 3 min，拍干；（2）封閉液封閉，同上洗板；（3）加入待檢鴨，在 37孵育 1.5 h，同上洗板；（4）加入工作濃度的酶標(biāo)抗體（HRP 標(biāo)記羊抗鴨 IgG 或 HRP 標(biāo)記兔抗鴨 IgG），在837 條件下孵育 0.5 h，同上洗板；加入TMB 顯色液，避光反應(yīng)；加入終止液（2 mol/L H2SO4），50 L/孔；（7）酶標(biāo)儀以雙波長(zhǎng)形式OD450-OD630 值；（8）選擇P/N 值最大者為最佳反應(yīng)條件。為了獲得最佳的檢測(cè)效果，

42、按表 5 所示條件優(yōu)化：表 5、間接ELISA 條件優(yōu)化優(yōu)化項(xiàng)目?jī)?yōu)化條件設(shè)置 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 五個(gè)梯度酶標(biāo)抗體工作濃度可溶性3D 蛋白作1:50(30g/mL)、1:100(16g/mL)、1:200(8g/mL)、1:400(4抗原濃度和血g/mL)、1:800(2g/mL)、1:1600(1g/mL)六個(gè)梯度；鴨性肝炎陽(yáng)/陰清稀釋度分別作 1:100、1:200、1:400、1:800 四個(gè)梯度，通過(guò)方陣法確定最性佳濃度和稀釋度設(shè)置 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min 六個(gè)顯色時(shí)間顯色時(shí)間設(shè)置 37

43、 1h 后 4過(guò)夜，37 4h 后 4過(guò)夜和直接 4過(guò)夜三個(gè)條件條件設(shè)置 1% BSA、5% BSA、1%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、1%小牛、5%封閉液選擇小牛、1%明膠、5%明膠八種封閉液封閉時(shí)間設(shè)置 30 min、60 min、90 min、120 min 四個(gè)梯度ELISA 方法的反應(yīng)條件優(yōu)化（1）最佳酶標(biāo)抗體濃度將酶標(biāo)抗體（KPL 公司的HRP 標(biāo)記羊抗鴨IgG，濃度為 100g /mL）分別作 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 濃度稀釋，每個(gè)濃度設(shè)置兩個(gè)重復(fù)，均于 37孵育，同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性，然后檢測(cè) OD450-OD630 值，并取平均值，結(jié)果如表 6 所示

44、。選擇 P/N 值最大者為最佳二抗稀釋度。表 6、酶標(biāo)抗體工作濃度優(yōu)化91:1001:2001:4001:8001:1600酶標(biāo)抗體稀釋度陽(yáng)性 OD4500.8930.7580.5370.4000.275OD4500.4380.3100.2220.1600.126P/N 值2.0392.4492.4212.4912.182由表 6 可知，酶標(biāo)抗體作 1:800 稀釋時(shí)效果最佳。（2）最佳抗原濃度及稀釋度將實(shí)施例 3 純化獲得的可溶性 3D 蛋白分別作 1:50、1:100、1:200、1:400、1:800 和 1:1600稀釋，鴨性肝炎陽(yáng)/分別作 1:100、1:200、1:400、1:80

45、0 稀釋，每個(gè)濃度設(shè)置 2個(gè)重復(fù)，檢測(cè) OD450-OD630 值后取平均值，結(jié)果如表 7 所示。選擇 P/N 值最大者為最佳條件。表 7、抗原濃度和稀釋度選擇抗原稀釋度稀釋度1:501:1001:2001:4001:8001:16001:100+1:100-P/N 值1:200+1:200-P/N 值1:400+1:400-P/N 值1:800+1:800-P/N 值0.8700.3882.2450.7500.2812.6680.4960.2072.3940.3430.1542.2360.8830.4102.1550.7170.2902.4760.5300.1952.7160.3660.18

46、02.0360.8920.4192.1270.7330.3262.2470.5430.2182.4930.3700.2051.8040.8830.3602.4540.7310.3182.2980.5230.1972.6550.3580.1841.9390.8860.4022.2030.6780.2672.5340.4910.1762.7900.3150.1631.9310.8430.3612.3370.6690.2492.6850.4580.1552.9630.2590.1611.609由表 7 可知，將可溶性 3D 蛋白作 1：1:1600，（3） 最佳顯色時(shí)間作 1：400 稀釋效果最佳。

47、將顯色時(shí)間分別設(shè)置為 5 min、10 min、15 min、20 min、25 min 和 30 min，每個(gè)顯色時(shí)間陽(yáng)性、均設(shè)置 4 個(gè)重復(fù)，均于 37避光顯色，然后檢測(cè) OD450-OD630 值，平均值，結(jié)果如表 8 所示。選擇P/N 值最大者為最佳顯色時(shí)間。表 8、最佳顯色時(shí)間選擇顯色時(shí)間(min)51015202530陽(yáng)性均值0.2290.0580.3670.1150.5230.1530.6100.1990.6920.2230.7190.224均值10PN 值3.9563.2063.4193.0673.1063.205結(jié)果顯示，顯色時(shí)間為 15 min 時(shí)效果最佳。（4） 最佳條件

48、分別在 37處理 1h 后在 4過(guò)夜，37處理 4h 后在 4過(guò)夜和直接在 4過(guò)夜三種條件下，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和，各 7 個(gè)重復(fù)，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 9所示。選擇P/N 值最大者為最佳條件。表 9、條件優(yōu)化條件371h 4過(guò)夜374h 4過(guò)夜4過(guò)夜陽(yáng)性均值0.5100.1393.6740.5100.1493.4280.5310.1214.383均值P/N 值由表 9 可知，在 4條件下（5）最佳封閉液、封閉時(shí)間過(guò)夜為最佳條件。分別以 1% BSA、5% BSA、1%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、1%小牛、5%小牛、1%明膠和 5%明膠為封閉液，每一種封閉液設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，并于 3

49、7條件下封閉，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 10 所示。然后設(shè)置封閉時(shí)間為 30 min、60 min、90 min、120min，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 11 所示。選擇 P/N 值最大者作為最佳封閉液、封閉時(shí)間。表 10、最佳封閉液選擇封閉液5%牛10%牛1%脫脂奶5%脫脂奶1%BSA5%BSA1%明膠5%明膠陽(yáng)性值0.4470.1732.5840.4520.1752.5890.4570.1922.3860 5080 2192 3200.6870.1773.8720.4310.1912.2600.4890.1892.5890.5070.2162.370值PN

50、值表 11、封閉時(shí)間選擇封閉時(shí)間0.5h1h1.5h2h陽(yáng)性0.5910.1493.9670.5040.1303.8900.5560.1723.2300.5880.1713.435P/N 值由表 10 和表 11 可知，最佳封閉液為 1% BSA，最佳封閉時(shí)間為 0.5 h。根據(jù)上述優(yōu)化條件構(gòu)建檢測(cè)I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒，具體為：可溶性I型鴨肝炎3D 蛋白的反應(yīng)板、酶標(biāo)抗體、顯色液和終止液，其中反應(yīng)板以濃度 1g/mL11的可溶性I 型鴨肝炎3D 蛋白按每孔 100L 加入反應(yīng)板中， 4過(guò)夜，次日PBST洗板 5 次，拍干，其效果最佳；酶標(biāo)抗體為HRP 標(biāo)記羊抗鴨IgG，所述顯

51、色液為T(mén)MB，所述終止液為濃度為 2 mol/L 的H2SO4。ELISA 檢測(cè)方法為：以 1g/mL 的可溶性 3D 蛋白液 4過(guò)夜，以 1% BSA 作為封閉液 37封閉 0.5h，稀釋度 1:400 于 37 孵育 1.5 h，HRP 標(biāo)記的羊抗鴨IgG 以 1:800 稀釋于 37孵育 0.5 h，顯色 15 min。利用根據(jù)上述ELISA 的優(yōu)化條件，檢測(cè) I 型鴨性肝炎抗體的ELISA 試劑盒的特異性：（1）特異叉實(shí)驗(yàn)用建立的 ELISA 試劑盒檢測(cè)鴨沙門(mén)氏菌（Sal）、鴨大腸桿菌（E.coli）、鴨腫頭敗血癥病毒（DSHDV）、設(shè)置鴨肝炎陽(yáng)性、H5（AIV）、鴨瘟（DPV）和鴨里

52、默氏桿菌（RA）陽(yáng)性，對(duì)照，每個(gè)設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，OD450-OD630 平均值，結(jié)果如表 12 所示。表 12、ELISA 試劑盒特異性檢測(cè)待檢SalE.coliDSHDVAIVDPVRADHAVOD 值0.0590.0720.0700.0770.0470.1200 5460.123與OD 值比值0.4800.5900.5700.6280.3860.9764.460/結(jié)果顯示，六種待檢陽(yáng)性與的比值均小于 2.1，表明建立的 ELISA 試劑盒特異性很好。（2）特異性阻斷實(shí)驗(yàn)用可溶性 3D 蛋白與 I 型鴨肝炎的陽(yáng)性按體積比為 10：1 混合，于 37中和 1h 后稀釋至最佳示。稀釋度，用建立

53、的ELISA 試劑盒檢測(cè)，計(jì)算阻斷率，結(jié)果如表 13 所表 13、ELISA 試劑盒阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性PN 值阻斷前 OD 值阻斷后 OD 值阻斷率0.6950.18972.8%0.1820.15216.4%3.821.24/結(jié)果顯示，陽(yáng)性阻斷率為 72.8%，阻斷率為 16.4%。表明可溶性 3D 蛋白能與鴨肝炎陽(yáng)性特異性識(shí)別并進(jìn)行中和。（3）變異系數(shù)12同一批純化的 3D 蛋白按不同批次酶標(biāo)條，然后檢測(cè) 6 份的 OD450-OD630 值，每份設(shè)置 6 個(gè)重復(fù)，檢測(cè)其變異系數(shù)作板內(nèi)、板間變異系數(shù)，變異系數(shù) CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值（SD/X100%），結(jié)果如表 14 和表 15 所示。表 14

54、、板內(nèi)變異系數(shù)測(cè)定OD450SD板內(nèi)變異系數(shù)1234560.2530.3900.6230.7020.3620.4150.0170.0100.0210.0130.0120.0116.57%2.69%3.31%1.91%3.19%2.63%表 15、板間變異系數(shù)測(cè)定OD450SD板間變異系數(shù)1234560.2330.3310.5730.6300.3520.3920.0160.0070.0150.0250.0200.0066.74%2.06%2.63%3.96%5.67%1.43%結(jié)果表明，板內(nèi)變異系數(shù)在 1.9%-6.6%，均小于 10%，板間變異系數(shù)在 1.4%-6.7%，均小于 10%。表明建

55、立的ELISA 試劑盒法重現(xiàn)性好。（4） 陽(yáng)性閾值確定以可溶性 3D 蛋白最佳稀釋度酶標(biāo)條，以最佳反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè) 60 份OD450-OD630 值，計(jì)算 cut-off 值=均值+3方差（Vcut-off=X+3SD），結(jié)果如表 16 所示。表 16、60 份OD450-OD630 值0.1300.1420.1640.1690.1350.1540.1830.1330.1190.2080.1760.1530.1410.1250.1880.1860.1500.1410.1240.1600.1890.1940.1660.1460.1770.1880.1880.1280.1680.1810.

56、1860.1300.1650.1710.1670.1660.1280.1620.1500.1440.1390.1760.1710.1990.1230.1910.1300.1110.1510.1900.1950.1770.1420.1450.1550.1430.1290.1420.1720.207取均值+3SD 作為陽(yáng)性閾值，結(jié)果顯示，陽(yáng)性閾值為 0.155+30.028=0.238。13（5）敏感性檢測(cè)取 8 份 I 型鴨性肝炎陽(yáng)性，分別從 1:100 開(kāi)始，以 2 倍倍比稀釋，用建立的ELISA 試劑盒檢測(cè)，以能檢測(cè)出陽(yáng)性的最大稀釋度為靈敏度，結(jié)果如表 17 所示。表 17、ELISA 試劑

57、盒靈敏度檢測(cè)血 清稀釋度123456781:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:256001:512001:1024001:2048000.9540.8680.6760.4980.3420.2790.2170.2000.1990.1880.1850.0550.7480.6340.4670.4110.3280.2800.2350.2210.2080.1970.1660.0731.0440.8660.6920.5070.3480.2580.2220.2060.2060.1920.1920.0460.8210.6990.5480.4260.318

58、0.2510.2240.1760.1530.1460.1540.0610.8870.7720.6420.4590.3360.2500.1920.1630.1530.1490.1380.0520.7730.6870.6210.5170.3500.2790.1940.1850.1660.1500.1470.0860.6160.5350.4500.3640.3050.2360.1980.1750.1620.1470.1450.0850.7110.6350.5320.4180.3310.2340.2070.1820.1760.1510.1450.079結(jié)果顯示，ELISA 試劑盒檢測(cè)I 型鴨性肝炎的靈

59、敏度為 1:3200。綜上可見(jiàn)，利用本發(fā)明制得的可溶性 3D 蛋白的 ELISA 試劑盒檢測(cè) I 型鴨性肝炎抗體具有特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、敏感度高的優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床樣品的檢測(cè)。實(shí)施例 5、可溶性 3D 蛋白與全ELISA 檢測(cè)的比較：全ELISA 檢測(cè)抗原的將 DHAV-1 弱毒的尿囊液原毒（為I 型鴨肝炎CH60 株，該株為本分離致弱的株，公開(kāi)于公開(kāi)號(hào)為 103103163A 的中國(guó)專利，保藏為 CCTCC NO.V201248）以滅菌 PBS 作 5 倍稀釋，添加相當(dāng)于稀釋液 1/100 體積的雙抗（青霉素、鏈霉素的終濃度分別為 100IU/mL 和 100g/mL）于 37溫育 1h 后接

60、種雞胚，每天照蛋兩次，24 h內(nèi)胚舍棄，收集 24-72 h 內(nèi)雞胚尿囊液和胚體，胚體經(jīng)-20凍融兩次并研磨后以適量PBS 懸浮，10000 r/min 離心 30 min 取上清與尿囊液混勻置-20保存?zhèn)溆谩HAV-1 弱毒液經(jīng) 10000 r/min 離心 30 min，取上清液 0.22 m 濾膜過(guò)濾后 45000r/min 離心 2 h，將沉淀以離心前液體積的 1/40 比例加入滅菌PBS 懸浮，分裝于-20 保存?zhèn)溆茫⒁院怂岬鞍變x檢測(cè)其蛋白濃度。全ELISA 方法 ，具體步驟如下：a.抗原反應(yīng)板，100 L/孔，37處理 1 h 后轉(zhuǎn)入 4過(guò)夜，次日 PBST 洗板 5 次，每