多糖的制備工藝研究(共9頁)

1、多糖(du tn)的生物(shngw)活性及制備(zhbi)工藝研究摘要： 多糖是一種自然界中含量豐富的生物大分子，其具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及多方面的生物活性功能。本文綜述了多糖的一些主要生物活性，如抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、抗補(bǔ)體等藥理作用，以及多糖的提取、分離純化等制備工藝的研究。其大致流程包括活性成分的確定、對原料藥物的預(yù)處理、最佳提取分離工藝的選擇、對粗品的提純及純化、精制多糖成品、多糖組分分析等。雖然近幾十年來多糖研究取得了很大進(jìn)步，由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性增加了研究的難度，因此多糖的分離純化方法發(fā)展依然緩慢，很多技術(shù)環(huán)節(jié)仍有待發(fā)展。關(guān)鍵詞：多糖；生物活性；制備工藝；提取；分離純化多糖是一類由

2、酮糖或者醛糖通過糖苷鍵連接而成的，為一種天然高分子多聚物，其在自然界含量豐富。多糖及其復(fù)合物是來自于高等植、 動物細(xì)胞膜和微生物細(xì)胞壁中的自然界含量豐富的天然大分子物質(zhì)之一，與人類生活緊密相關(guān)，對維持生命活動起著至關(guān)重要的作用和蛋白質(zhì)、核酸、脂類構(gòu)成了最基本的4類生命物質(zhì)1。本文就國內(nèi)外多糖的提取工藝方面作一綜述，為進(jìn)一步研究其生物活性奠定基礎(chǔ)。1 多糖的生物活性1.1抗腫瘤作用具有抗腫瘤活性的多糖大多是無毒性且具有諸如誘導(dǎo)細(xì)胞分化、刺激造血、抗轉(zhuǎn)移2、抗新生血管生成3和誘導(dǎo)NO產(chǎn)生4等生物活性。它們大多不直接作用于腫瘤細(xì)胞，而是通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)起作用,即促進(jìn)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷

3、細(xì)胞的成熟、分化和繁殖5，同時活化網(wǎng)上內(nèi)皮系統(tǒng)和補(bǔ)體，促進(jìn)各種細(xì)胞因子的生成6，最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長或?qū)е履[瘤細(xì)胞的凋亡。1.2 抗病毒作用20世紀(jì)70年代以后發(fā)現(xiàn)有些多糖具有抗皰疹病毒及流感病毒作用，特別是80年代發(fā)現(xiàn)多糖具抗艾滋病病毒(HIV)作用。1.3 降血糖作用多糖是有10個以上單糖縮合去水，以糖苷鍵形式結(jié)合形成的多聚糖。它與單糖、寡糖的性質(zhì)不同，不但不會使血糖升高,而且能降低血糖。有望成為一類新的降血糖藥物。1.4 抗補(bǔ)體(bt)作用補(bǔ)體系統(tǒng)是人體的重要免疫防御系統(tǒng)之一，但過度激活會引起諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、重癥非典型肺炎(SARS)等許多疾病。至今尚無理想治療藥物，因此臨床上急需(

4、jx)高效低毒的補(bǔ)體抑制劑藥物。2 多糖(du tn)的制備工藝流程2.1 多糖的預(yù)處理2.1.1 凈制 取新鮮的樣品，用刷子將其表面的泥沙刷去。2.1.2 清洗 將樣品經(jīng)少許石油醚脫表面油脂，用去離子水洗滌至中性。2.1.3 干燥 用真空冷凍干燥的方法干燥，或者干燥箱中干燥，干燥應(yīng)以恒重為準(zhǔn)。2.1.4 粉碎 粉碎應(yīng)過40目篩子，費(fèi)穗成適當(dāng)?shù)姆勰┖髠溆谩?.1.5 樣品脫脂 取干燥的粉未樣品，用乙酸乙酯、丙酮進(jìn)行索氏提取各6h以除去脂肪。2.1.6 酶處理準(zhǔn)確稱取一定量的脫脂粉，按-淀粉酶與茯苓脫脂粉質(zhì)量比為110的比例加入-淀粉酶，按一定的料液比置于三角錐形瓶中，放置于一定溫度的恒溫水浴鍋

5、中酶解30 min。2.1.7 滅酶置于90 水浴20 min。2.2 多糖的提取多糖既可存在細(xì)胞壁外， 又可存在細(xì)胞壁內(nèi)中，因此，從動、植物中提取多糖，首先就要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理，使多糖從細(xì)胞中容易釋放出來。因破碎后的細(xì)胞，其中含有脂類物質(zhì)，容易連同多糖被提取出來，故需預(yù)處理。 一般采用醇和醚類物質(zhì)浸泡或回流提取來除去脂質(zhì)，此時一些脂溶性色素也容易被除去， 脫脂后的樣品再用于多糖的提取， 以水、鹽溶液、稀酸及稀堿在不同條件下提取。提取液濃縮后經(jīng)透析、沉淀、干燥得到粗多糖。近年來，微波、超聲和酶法輔助提取技術(shù)也開始應(yīng)用于多糖的提取7-8。 存在(cnzi)于細(xì)胞壁中的多糖(du tn)，按照(

6、nzho)溶解度的不同又分為水溶性多糖和堿溶性多糖9。通常采用水提醇沉法、堿提醇沉法提取。水溶性多糖的提取主要與提取次數(shù)、時間、固液比及溫度等因素有關(guān)。隨著提取次數(shù)增多，多糖的浸出率明顯增高，但提取次數(shù)不易過多，一般為兩次。雖然提取時間延長可提高多糖的浸出率，但浸提時間過長，將造成提取工藝延長。同時，還有可能增加雜質(zhì)的溶出，通常選3h。堿溶性多糖的提取一般在4下進(jìn)行，其影響因素除以上幾點(diǎn)外，還與堿濃度有關(guān)，常采用0.5mol/L。在乙醇沉淀步驟中，浸提液濃縮比及乙醇加量是影響多糖沉淀率的主要因素。2.2.1 水提醇沉法 稱取一定量樣品粉末熱水浸提抽濾濾液減壓濃縮(浸提液濃縮液=101) 95%

7、乙醇沉淀（含醇量達(dá)80%）于冰箱中靜置過夜離心沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌真空干燥得藥物多糖粗品10。該法采用水作為溶劑，具有價廉、無毒、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是浸提時間長且提取率較低。2.2.2 稀堿浸提法11 取樣品粉末15g溶于3的015molPL NaOH 3000mL液中,攪拌至粉末溶解,此時溶液呈粘稠狀態(tài)。5以下冷藏,過夜,抽渣棄去,濾液以10%的醋酸液中和至酸性,再加入等量95%乙醇,于3放置過夜,濾取沉淀,流水透析兩天,再依次用蒸餾水、無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后,減壓抽干,置干燥箱中60以下干燥,即得樣品多糖粗品,呈淡黃色細(xì)顆狀結(jié)晶。該法提取率較水提醇沉法高，但浸提程序較繁

8、瑣，浸提條件較劇烈，極易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)，使其生物活性受到限制。2.2.3 酶解+熱水浸提法 12 將一定量的樣品粉末加水浸泡30min(復(fù)合酶加水在40活化10min)加入復(fù)合酶在48(PHS)浸提90min中和后加水再升溫至80繼續(xù)浸提90min乙醉醇沉,無水乙醉、丙酮、乙醚分別洗滌獲多糖粗品。酶解法可以在較低的溫度下提高多糖的提取率，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，浸提時間縮短，得率提高，是水溶性多糖的好方法。2.2.4 發(fā)酵(f jio)醇沉法13 發(fā)酵醇沉法提取(tq)多糖包括胞外多糖的提取及胞內(nèi)多糖的提取，前者(qin zh)將菌絲提取搖瓶培養(yǎng)10d，分離發(fā)酵上清液，在上清液中加入3倍量

9、的95%乙醇，過夜,過濾得沉淀。沉淀相繼用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，得胞外多糖。后者包括胞內(nèi)水溶性多糖及堿溶性多糖的提取，水溶性多糖的提取:取有機(jī)溶劑處理（脫脂）后的菌絲體粉末采用水提醇沉法進(jìn)行提?。粔A溶性多糖的提取:將上述提取水溶性多糖后的菌絲體濾渣用5 倍量0. 5 mol/L 的氫氧化鈉溶液浸提，步驟同稀堿浸提法。液體發(fā)酵具有易于操作、節(jié)約資源、產(chǎn)率高、周期短、可大規(guī)模投入工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為獲取多糖的主要方法14。但研究表明15，發(fā)酵菌絲體中總多糖的提取率較天然菌絲低，這可能因?yàn)榘l(fā)酵菌絲體多糖的提取工藝不完善，有待進(jìn)一步優(yōu)化，也可能由于發(fā)酵菌絲體中總多糖占總糖的比例低于天然菌絲。2.

10、2.5 微波、超聲波輔助提取法 微波提取法利用加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞，進(jìn)而出現(xiàn)裂紋，從而使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)產(chǎn)物16。稱取10g的樣品粉末,溶解于500mL的溶液中,提取30min,在42%的微波占空比下回流提取后濾過,殘渣依法再提取兩次,合并濾液,低溫濃縮至50mL。該法具有受熱均勻、快速、高效、安全、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，近年來，普遍應(yīng)用于多糖的提取。超聲波提取技術(shù)也是近年來發(fā)展起來的一種提取生物活性物質(zhì)的方法，具有方便、快速、提取物活性高的特點(diǎn)。趙聲蘭等17采用超聲波法提取多糖，但提取率不高，最高達(dá)到1.

11、6%。隨著醫(yī)藥、化學(xué)以及生物學(xué)的不斷發(fā)展，多糖的提取取得了很大進(jìn)展，酶+熱水浸提法顯著提高了多糖的提取率，同時縮短了提取時間。然而，水溶性多糖的提取率仍較低，一般不超過6%，因此，有必要進(jìn)一步改進(jìn)多糖的提取工藝，提高提取率。同時，應(yīng)深入研究液體發(fā)酵生產(chǎn)多糖的方法，從而節(jié)約資源，適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。然而對于微波、超聲波輔助提取法由于該法具有受熱均勻、快速、高效、提取物活性高等特點(diǎn)正處于快速發(fā)展階段，越來越被人們所重視。3 多糖提取液中雜質(zhì)(zzh)的去除3.1 Sevag法除蛋白(dnbi)粗多糖溶液加入Sevag試劑(氯仿:異戊醇=3:1混合搖勻)后，置恒溫振蕩器中震蕩過夜，使蛋白質(zhì)充

12、分沉淀，離心(3 000 r/min)分離,去除蛋白質(zhì)。脫游離蛋白后，上葡聚糖凝膠柱分離純化。選用Sephadex G-15葡聚糖凝膠，將已充分膨脹的葡聚糖凝膠濕法裝柱，用氯化鈉水溶液進(jìn)行平衡。樣品上柱后，用蒸餾水洗脫，分部收集。洗脫液經(jīng)不同濃度乙醇沉淀,離心，干燥(gnzo)沉淀即得較為純化的樹舌多糖Ga-1、Ga-2、Ga-3 3個級分和茯苓多糖Pc-1，Pc-2,Pc-3 3個級分。3.2 沉淀洗滌沉淀中加入一定比例無水乙醇，離心、去上清；加入一定比例丙酮，離心、去上清；加入一定比例乙醚，離心、去上清。4 多糖的純化18,19-23多糖的純化是指將復(fù)雜的混合多糖分離純化變成一個個單一的多

13、糖。4.1 分步沉淀法它是根據(jù)不同的多糖在低級醇或酮(通常是乙醇或丙酮)中具有不同溶解度而進(jìn)行分離。分子量大的多糖較分子量小的多糖在乙醇(或丙酮)中的溶解度小,所以逐步加大乙醇(或丙酮)的濃度可將不同分子量的多糖分別沉淀出來。4.2 鹽析法它是根據(jù)分子量不同的多糖在一定濃度的鹽溶液中具有不同溶解度的性質(zhì)分離各種多糖。在多糖中加入中性鹽(如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等)至一定濃度,則在該鹽濃度時溶解度最小的多糖便沉淀析出,然后上清液繼續(xù)加鹽至更高濃度,則另一多糖又沉淀析出。鹽析法在蛋白質(zhì)純化上用得很多。4.3 屬絡(luò)合法根據(jù)不同多糖能與各種銅、鋇、鈣和鉛離子形成絡(luò)合物而沉淀的性質(zhì)進(jìn)行多糖

14、的純化。常用的絡(luò)合劑有氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。得到的絡(luò)合物沉淀經(jīng)水充分洗滌后,用酸分解,得到游離的多糖。在多糖的純化中最常用的是銅鹽絡(luò)合法及氫氧化鋇絡(luò)合法。4.4 有機(jī)鹽沉淀法2000年美國專利(US75920000111)報道從植物與微生物中提取粘多糖或蛋白多糖的方法,其在多糖溶液中加入有機(jī)酸單寧使其與多糖形成有機(jī)鹽復(fù)合物而沉淀。離心,沉淀用有機(jī)溶劑或其他物質(zhì)使多糖復(fù)合物中的單寧除去。4.5 季胺鹽沉淀法根據(jù)長鏈季胺鹽能與酸性多糖或長鏈高分子量多糖形成絡(luò)合物,在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶解的特性,使其沉淀析出(xch),然后增加溶液的離子強(qiáng)度到一定范圍,絡(luò)合物則逐漸離解,最終溶解。4.6

15、柱層析方法(fngf)柱層析方法是目前多糖中應(yīng)用最多的方法,原因是效果好,操作簡單。主要(zhyo)分為纖維素柱層析和陰離子交換柱層析。5 干燥將醇沉物置于60 恒溫干燥箱中進(jìn)行干燥，干燥后的產(chǎn)物即為多糖。6 組分分析稱取少許的多糖(0.1克)于2.0 ml離心管中，加入1 M的硫酸1 ml，沸水浴水解2 h，然后加氫氧化鋇中和至中性，過濾除去硫酸鋇沉淀，得多糖水解澄清液，以此進(jìn)行點(diǎn)樣；薄層層析法一般只展開1次，為達(dá)到較好分離效果,實(shí)驗(yàn)選用二次展開法，即：在第1種展開劑中展開后，晾干，再放入第2種展開劑中進(jìn)行層析展開。多糖的制備工藝的流程如下：原料預(yù)處理(清洗)干燥、切片、稱量（080熱水浸提

16、，35 h）提取液過濾重復(fù)提取3次,合并濾液減壓濃縮至1/2體積多糖提取液脫色乙醇沉淀多糖(上清液回收酒精)沉淀(粗蛋白多糖)加適量的蒸餾水?dāng)嚢杓觭evag試劑除蛋白離心上清液(棄沉淀)過柱，分步收集乙醇分級沉淀精制多糖(Ga-1、Ga-2、Ga-3和Pc-1、Pc-2、Pc-3)單糖組分分析結(jié)語及前景 多糖是一種能夠增強(qiáng)人體免疫功能的生物活性物質(zhì)，國際學(xué)術(shù)界稱之為生物應(yīng)答效應(yīng)物，目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)、食品科學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域中的熱點(diǎn)研究內(nèi)容之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐級認(rèn)識到糖及其復(fù)合分子具有極其重要的生物學(xué)功能，多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療

17、等都有著密切的關(guān)系。因此，對于多糖的制備工藝的研究顯得更加的重要，以上初步地闡述了多糖的生物活性及制備工藝流程。參考文獻(xiàn)1 JB Lowe，JD Marth. A genetic approach to mammalian glycan functionJ. Annual Review of Biochemistry，2003，72(1):643-691.2Kimura Y,Sumiyoshi M,Suzuki T,et al.Antitumor and antimeta-static activity of a novel water-soluble low molecular weight

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