多抗制備課件

1、多克隆抗體的制備及抗體效價測定 第1頁，共50頁。目的要求掌握多克隆抗體制備的基本原理。掌握多克隆抗體制備的操作步驟。掌握肥達反應(yīng)的實驗原理、操作流程和結(jié)果判斷。熟悉ELISA的實驗原理、操作流程和結(jié)果判斷。了解細菌抗原和病毒抗原免疫程序上的異同。了解免疫動物的選擇原則。第2頁，共50頁。原理1、克隆(clone)： 是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。2、多克隆抗體（polyclonal antibody, pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的

2、不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。第3頁，共50頁。 3、單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAb）：由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反應(yīng)性。第4頁，共50頁。 抗體的制備技術(shù)經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因

3、工程抗體(genetic engineering antibody)。第5頁，共50頁。Ab1Ab3Ab4單克隆抗體抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗體）脾B細胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤細胞HAT培養(yǎng)，稀釋單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意圖雜交瘤細胞+ PEG, 融合Ab2第6頁，共50頁。 多克隆抗體制備流程（一）免疫原的制備（二）免疫動物（三）免疫血清的收集（四）免疫血清的鑒定（五）免疫血清的保存第7頁，共50頁。操作步驟一、免疫原的制備免疫原（immunogen）指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（im

4、munogenicity）免疫原天然抗原、人工 合成抗原； 蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原； 第8頁，共50頁。（一）細胞性抗原制備： 綿羊紅細胞（SRBC）- 溶血素； 細菌- 抗菌抗體（動物免疫血清）（二）可溶性抗原制備： 指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。第9頁，共50頁。1）細胞的破碎（物理法、化學(xué)法）反復(fù)凍融法超聲破碎法自溶法酶處里法表面活性劑處理法第10頁，共50頁。2）提取與純化：超速離心分離是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。第11頁，共50頁。選擇性沉淀選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境。 核酸去

5、除 鹽析沉淀法 有機溶劑沉淀法 高分子聚合物沉淀法例： 50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出學(xué)清球蛋； 8%12%PEG6000可沉淀IgG。第12頁，共50頁。 鹽析法沉淀抗原的機理 第13頁，共50頁。超濾法利用孔徑大小不同的特制薄膜對不同分子大小的抗原物質(zhì)進行濾篩。層析法 凝膠過濾 離子交換 親和層析電泳（略）第14頁，共50頁。 凝膠過濾層析( 分子篩)的作用機理第15頁，共50頁。 親和層析的作用機理第16頁，共50頁。3）鑒定： 鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、 純度以及免疫學(xué)活性。蛋白的含量定氮（紫外光280nm等）分子的質(zhì)量電泳、質(zhì)譜蛋白的純度電泳等免疫學(xué)活性免疫雙擴散、免疫印

6、跡第17頁，共50頁。 抗原性質(zhì)分析結(jié)果第18頁，共50頁。（三）半抗原性免疫原的制備1.載體選擇常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生良好的抗體。第19頁，共50頁。2.連接方法 半抗原與載體的連接有物理法和化學(xué)法。物理法 是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載

7、體主要有PVP和CMC等；化學(xué)法 是利用某些功能基團把半抗原連接到白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進行連接。第20頁，共50頁。 根據(jù)半抗原擁有的化學(xué)基團不同，連接方法主要有以下幾類：帶游離氨基或羧基以及二種基團皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連接。帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。第21頁，共50頁

8、。（四）免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑。 第22頁，共50頁。佐劑的種類 佐劑一般包括以下幾類：無機佐劑： 如氫氧化鋁、明釩等生物性佐劑： 如結(jié)核分枝桿菌、卡介苗、小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、霍亂毒素的B亞單位、胞壁酰二肽和細胞因子等；人工合成佐劑： 如雙鏈多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、雙鏈多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油劑：如弗氏完全佐劑、花生油乳劑等；納米佐劑 第23頁，共50頁。 弗氏佐劑（Freunds adjuvant

9、）,分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種：前者是由油劑（礦物油或花生油）和乳化劑（羊毛脂或吐溫-80）按1：11：5比例混合而成；后者由弗氏不完全佐劑加卡介苗組成。在免疫動物時，先將弗氏佐劑與抗原等比混勻，制成“油包水”乳化液。 第24頁，共50頁。 佐劑與抗原混合乳化的方法：研磨法攪拌混合法第25頁，共50頁。 2. 佐劑的免疫生物學(xué)作用增強抗原免疫原性：使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成持久或強的免疫原；增強機體對抗原刺激的反應(yīng)性，提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體滴度；改變抗體類型，使產(chǎn)生抗體由IgMG型轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG型；引起或增強遲發(fā)性超敏反應(yīng)。第26頁，共50頁。3. 佐劑的作用機制 佐劑的作用

10、機制歸納起來主要有如下幾種：可增強抗原的表面積和改變抗原活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性。佐劑與抗原混合一起注入機體，可改變抗原的物理性狀，形成抗原儲存庫，延長抗原在局部組織的滯留時間，有利于抗原的緩慢釋放。增強吞噬細胞的吞噬作用（被佐劑吸附的抗原易被吞噬細胞吞噬），促進對抗原的處理，刺激淋巴細胞增生，從而增強和擴大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。 第27頁，共50頁。二、動物免疫（一）免疫動物的選擇 選擇動物時應(yīng)考慮以下因素：抗原來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠，其免疫源性越強，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合要求的正常動物（

11、以雄性為佳）；抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物?？乖再|(zhì)與動物種類第28頁，共50頁。（二）免疫方法 選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。 (1) 免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來確定。首次免疫時，劑量不宜過大，以免產(chǎn)生免疫麻痹。第29頁，共50頁。 (2) 免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。 免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免

12、疫的間隔時間尤為重要，一般以1020天為佳，二次后間隔時間一般為710天，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。 第30頁，共50頁。常規(guī)制備痢疾致賀菌、傷寒桿菌抗血清的免疫方案 日期（天）16/711/1416/2121/2726/34途徑皮內(nèi)靜脈靜脈靜脈靜脈靜脈抗原熱殺死菌熱殺死菌活菌活菌活菌活菌劑量（mL）1.00.50.20.51.02.0第31頁，共50頁。常規(guī)制備NDV、VSV抗血清的免疫方案日期（天）16/711/1416/2121/2726/34途徑皮內(nèi)靜脈靜脈靜脈靜脈靜脈抗原弗氏完全佐劑 單純抗原單純抗原單純抗原單純抗原單純抗原劑量（mL）1.00.50.20.51.02

13、.0第32頁，共50頁。三、動物采血采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 (1) 頸動脈采血法 (2)心臟采血法 (3)靜脈采血法第33頁，共50頁。 頸動脈分離圖 第34頁，共50頁。四、免疫血清的鑒定1. 效價的測定：顆粒性抗原可采用凝集試驗，可溶性抗原常用雙向免疫擴散試驗、ELISA等方法。第35頁，共50頁。玻片凝集試驗肥達試驗（微量法）：(Widals test )ELISA第36頁，共50頁。 肥達試驗（Widal test）是用已知的傷寒桿菌O、H抗原和甲、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人血清做定量凝集試驗，以測定患者

14、血清中有無相應(yīng)抗體，根據(jù)抗體含量的多少以及增長情況，可幫助診斷傷寒及副傷寒。 【原理】 第37頁，共50頁。 1抗原：傷寒桿菌“O”、“H”及甲、乙型副傷寒菌液。 2待檢血清（須經(jīng)5630min滅活）。 3生理鹽水、24孔細胞反應(yīng)板、中號試管、吸管、水浴箱等?！静牧稀康?8頁，共50頁。 1取小號試管1支，加生理鹽水3.8ml，用吸管吸取患者血清0.2ml加入其中混勻，即為1：20稀釋血清，總量為4ml。 2取1塊24孔細胞培養(yǎng)板，每排第1孔分別標上“O”、“H”、“PA”、“PB”符號。 3. 第1排第2孔至第5孔各加0.4 mL生理鹽水。每排第6孔為對照孔，各加生理鹽水0.1mL。 【操作

15、步驟】第39頁，共50頁。 4. 第1排第2孔至第5孔各加0.4 mL生理鹽水。每排第6孔為對照孔，各加生理鹽水0.1mL。 5. 每排第1孔各加1：20的血清0.1 mL。 6. 第1排的第2孔加1：20的血清0.4 mL，從第2孔開始按倍比稀釋法稀釋血清，即第2孔吹吸混勻后取0.4 mL至第3孔，再從第2孔依次取0.1mL至第2、3、4排的第2孔，第3孔混勻后取0.4以此類推直至第5孔孔，從第5孔棄去0.4mL。 第40頁，共50頁。 這樣各排第1孔至第5孔的血清稀釋度為1：20、1：40、1：80、1：160、1：320。 6. 按H、O、PA、PB標記符號，第1排1-5孔加入“O”型傷

16、寒桿菌實驗菌液，第2排各孔加入“H”型傷寒桿菌實驗菌液，第3排加入甲型副傷寒桿菌實驗菌液，第4排加入乙型副傷寒桿菌實驗菌液，每孔均加入實驗菌液0.1mL。 7. 輕輕振搖反應(yīng)板，使其混勻，置37恒溫箱23小時觀察結(jié)果。 第41頁，共50頁。肥達反應(yīng)稀釋法示意表試驗管（每管0.2ml） 對照管 123456血清稀釋度1:201:401:801:1601:320（NS 0.5ml） 1“O”抗原 0.20.20.20.20.20.22“H”抗原0.20.20.20.20.20.23PA抗原0.20.20.20.20.20.24PB抗原0.20.20.20.20.20.2血清最終稀釋度 1:401:

17、801:1601:3201:640-第42頁，共50頁?！窘Y(jié)果】 各孔凝集程度的判斷以肉眼可見：孔內(nèi)上清液完全清亮，細菌全部形成凝塊記為“+ + + +”；孔內(nèi)上清液透明度達75%，大部分細菌形成明顯可見的凝集塊為“+ + +”；孔內(nèi)上清液透明度達50%，約50%細菌形成明顯可見的凝集塊為“+ +”；孔內(nèi)上清液透明度只達25%；僅有小部分細菌形成小凝塊為“+”，孔內(nèi)液體均為混濁；無凝集塊，細菌沉于孔底呈白色圓點狀，邊緣清晰為“”。（圖示）第43頁，共50頁。肥達反應(yīng)結(jié)果圖第44頁，共50頁。 血清的凝集效價（滴度）：是指能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見的明顯凝集（即“+”凝集）的血清最高稀釋倍數(shù)。

18、血清效價代表血清中抗體的含量，血清效價越高，所含抗體的量愈多。一般認為，傷寒沙門菌“O”抗體凝集效價在1：80以上，“H”抗體在1：160以上，甲、乙型副傷寒沙門菌凝集效價在1：80以上才有診斷價值。第45頁，共50頁。操作步驟ELISA第46頁，共50頁。2. 特異性的鑒定：抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴散法、免疫電泳法3. 純度的鑒定： 抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS）、雙向擴散試驗、免疫電泳等方法。 IgG含有重鏈和輕鏈，純IgG的SDS結(jié)果應(yīng)有兩條蛋白電泳帶（分子量約53kD和22kD），若出現(xiàn)多條電泳帶則表明制備的抗體混有雜蛋白，需進一步純化。4. 親和力的鑒定：測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗等。第47頁，共50頁。單抗親合常數(shù)的測定：單抗親合常數(shù)測定采用非競爭酶免疫試驗法：1）先確定在某一抗原濃度時抗體可以達到飽和；2）以該抗原濃度為實驗條件，飽和時的OD值作為OD-100，找