腫瘤病毒與腫瘤基因調控

1、病毒與腫瘤基因調控2012年中國腫瘤登記年報西方國家腫瘤發(fā)病率趨于平穩(wěn)我國持續(xù)上升惡性腫瘤是危害國民健康的第一號殺手2012年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒中國2012年居民死因比例分析每年新發(fā)病例約312萬 死亡病人約270萬 中國腫瘤的整體治療效果與美國存在差距GLOBOCAN 2008中國死亡率美國死亡率死亡率=死亡人數/發(fā)病人數腫瘤病因化學致癌因素苯白血病聯苯胺膀胱腫瘤物理致癌因素電磁輻射腦腫瘤，甲狀腺腫瘤生物致癌因素細菌 如幽門螺桿菌胃癌病毒 如HPV-宮頸癌霉菌 如黃曲霉菌肝癌遺傳因素結腸癌6感染相關腫瘤占所有腫瘤病例的18.6%（全球范圍內）惡性腫瘤主要的感染因素Parkin et al. G

2、lobal Cancer Stastics, 2002. 7感染相關腫瘤占發(fā)展中國家病例的23% 尤其在我國發(fā)病率高20042005年我國主要腫瘤死亡率（每10萬人）感染相關腫瘤總死亡率達91.69/10萬（男）和42.95/10萬（女）肺癌 41.14肝癌 37.36胃癌 32.29食管癌 20.4結直腸癌 8.32白血病 4.24腦瘤 3.50胰腺癌 2.91膀胱癌 2.12鼻咽癌 2.0419.63 肺癌 16.43 胃癌14.30 肝癌 9.38 食管癌 6.34 結直腸癌 5.86 女性乳腺癌 4.32 子宮癌 3.39 白血病 2.84 宮頸癌 2.72 腦瘤資料來源：2004-2

3、005年中國惡性腫瘤死亡抽樣回顧調查 8感染性腫瘤研究的重大突破使得相關腫瘤的預防成為可能201？200820051976HPV與宮頸癌（諾貝爾獎）幽門螺旋桿菌與胃癌（諾貝爾獎）HBV與肝癌（諾貝爾獎）EBV與鼻咽癌HPV與食管癌WarrenMarshallZur HausenBlumberg Making Cancer Preventable病毒的定義病毒是一種非常小的感染性細胞內(分子)專性寄生物，其基因組只包含一類核酸(DNA或RNA)；子代病毒顆粒是由宿主細胞新合成的物質裝配形成的；在感染周期中產生的子代病毒顆粒是病毒的基因組侵入下一宿主細胞或生物體的載體。 WHAT ARE VIRI

4、ONS? Virus particlesINERT CARRIERS of the genomeASSEMBLED inside cellsDo not GROW, and do not form by DIVISIONspacecraft : taking viral genomes from cell to cell, and protecting the genome in inhospitable environments 螺旋對稱型20面體對稱型復合對稱型/frames/virus-2-frame.html病毒的發(fā)現1884 C. Chamberland 過濾消毒方法(去除細菌)18

5、92 D. IWANOWSKI 過濾患有煙草花葉病的植物，發(fā)現經過除菌的溶液能使新的宿主致病1898 Beijerinck M 命名為煙草花葉病毒 （ TOBACCO MOSAIC VIRUS）/frames/virus-2-frame.html過濾汁液汁液病毒的基本特點1、體積微小，以nm計算，能通過細菌濾器，用電鏡觀察；2、非細胞結構：無包膜病毒僅由一種核酸和一個蛋白質外殼組成；3、基因組：RNA或DNA;4、嚴格細胞內寄生；5、以復制方式繁殖；6、對抗生素不敏感。包膜子粒包膜核心衣殼殼粒核衣殼吸附病毒的增殖過程穿入脫殼早期蛋白晚期蛋白裝配DNA復制核酸游離成熟釋放細胞對微生物的識別與應答

6、Cell. 1996;86(6):973-83.Toll Toll-like Receptors (TLRs)Toll-like Receptors (TLRs)模式識別受體：Pattern Recognition Receptor (PRR)全部由胚系基因編碼組成性地表達引起快速應答能夠識別各種病原體病原體相關分子模式:Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)RIG-I-like Receptors (RLRs)IPS-1 / VISA / MAVS / Cardif舒紅兵 院士（武漢大學）DNA sensorscGAS-STING pathw

7、ayZhijian Chen（美國西南醫(yī)學中心）天然免疫信號通路匯總Nat Rev Rheumatol. 2010 Mar;6(3):146-56. 炎癥小體（inflammasome）什么信號、物質活化炎癥小體？邵峰 院士（NIBS）Burkholderia cenocepacia （伯克霍爾德氏菌）inactivates RHOA by deamidating Asn 41, and thereby triggers Pyrin inflammasome activationType I interferonInterferon Stimulated Genes (ISGs)MxA蛋白天然

8、免疫反應的平衡TASK: 哪些因子參與了天然免疫/炎癥的消退過程？尋找炎癥調控基因（1.0版）J Immunol. 2013 Sep 1;191(5):2614-23.尋找炎癥調控基因（2.0版）Cell. 2015 Jul 30;162(3):675-86EZH2負調控I型干擾素表達J Immunol. 2013 Sep 1;191(5):2614-23.SOCS3負調控I型干擾素表達Mol Cell Biol. 2015 Jul;35(14):2400-13.“神人” “牛人” “路人”開創(chuàng)理論，提出預言愛因斯坦開創(chuàng)相對論預言時空彎曲、引力波孟德爾開創(chuàng)遺傳學預言“遺傳因子”，即基因驗證預言

9、，完善理論體系DNA是基因的物質基礎沃森、克里克雙螺旋是DNA的結構基礎灌水灌水灌水腫瘤病毒凡能在人或動物引起腫瘤或在體外能使細胞惡性轉化的病毒都稱為致瘤性病毒。與病毒感染相關的腫瘤特征：1、人群的感染率總是高于相關腫瘤的發(fā)生率；2、腫瘤的發(fā)生通常在感染許多年后出現。長時間的潛伏提示病毒感染細胞后需要多個基因變化才能產生疾病表型;3、大約與20的人類腫瘤相關。致瘤病毒與人類腫瘤1908年 Ellerman和Bang用雞白血病的無細胞濾液感染雞，雞可發(fā)生白血病1911年 Rous用可過濾因子成功地誘發(fā)了雞的肉瘤1947年 Claude等觀察到病毒顆粒, 命名為Rous肉瘤病毒 Figure 3.

10、1 The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) 1966 Nobel Prize in Medicine and Physiology Peyton Rous 1966 Nobel PrizeFigure 3.2 The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)Rouss protocol for inducing sarcomas in chickensFigure 3.7a The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)Figure 3.7b The Bio

11、logy of Cancer ( Garland Science 2007)Figure 3.8 The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) Rous肉瘤病毒是第一個被證實的致瘤病毒致瘤病毒與宿主細胞相互關系的研究逆轉錄酶的發(fā)現第一個癌基因(src基因）在病毒基因中的定位等 都是在這一系統(tǒng)中研究獲得的具有重要意義的結果VirusMalignancyHTLV-IAdult T-cell leukemia/LymphomaHTLV-IIHairy cell leukemiaHBV、HCVLiver CancerHHV-8Kaposis sarcoma

12、EBVLymphoproliferative disordersEBVNasopharyngeal carcinomaEBVBurkitts lymphomaEBVGastric carcinomaHPVCervical、Head and neck cancer目前已知腫瘤相關病毒及其引起的腫瘤根據腫瘤病毒基因組核酸的不同可以分為兩大類：1. DNA腫瘤病毒2. RNA腫瘤病毒（一）主要致瘤性DNA病毒人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV)多瘤病毒 (polyomavirus)人類皰疹病毒（human herpesvirus, HHV)： HHV4(EBV), HH

13、V8乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) 人乳頭瘤病毒（human papillomavirus, HPV)/h54329877.htm乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV)/lecture/retro.htm致瘤性DNA病毒的基本特性DNA病毒感染宿主細胞后,根據病毒能否復制分為:允許性感染 (permissive infection )：病毒產生轉化蛋白，在核內形成病毒顆粒，細胞裂解，釋放新的病毒顆粒，所以又稱裂解性感染。2. 非允許性感染(non-permissive infection)：病毒基因組整合到細胞的 DNA中，使細胞發(fā)生轉化。

14、致瘤性DNA病毒SV40感染過程Oncogene (2005) 24, 77297745致瘤性DNA病毒的共同特點：1、病毒的致癌作用發(fā)生在病毒進入細胞后復制的早期階段，相關的癌基因多整合至宿主細胞DNA上。2、DNA病毒編碼的蛋白質主要為核蛋白，直接調節(jié)細胞周期，并與抑癌基因相互作用例如腺病毒編碼E1A、E1B轉化蛋白乳多空病毒SV40編碼的T抗原HPV16和HPV18編碼的E6、E7轉化蛋白這些蛋白均可與重要的抑癌基因Rb、p53相互作用，使細胞周期發(fā)生紊亂。腺病毒編碼E1A轉化蛋白/ask/ask359uHPV編碼的E6、E7轉化蛋白/ask/ask359（二）致瘤性RNA病毒致瘤性RN

15、A病毒主要包括白血病增生型病毒和肉瘤病毒。新型病毒：Torque Teno virus (TTV) 圓環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬Torque Teno virus（TTV）是1997年從輸血后非甲-戊型肝炎病人中分離到的新病毒，又因TTV與輸血傳播病毒(Transfusion transmitted virus，TTV)巧合，因此被許多科學家亦稱為輸血傳播病毒。2010 EBV Meeting 致瘤病毒的特征 (一)1、誘發(fā)腫瘤：在實驗條件下，有的致瘤病毒能在同一動物引起多種腫瘤，如多瘤病毒可使小鼠產生23種不同部位和不同組織類型的腫瘤；有的致瘤病毒可使多種動物發(fā)生腫瘤，如雞肉瘤病毒不僅誘發(fā)禽類的腫瘤

16、，也可誘發(fā)哺乳動物發(fā)生腫瘤。致瘤病毒的特征 (二)2、傳播方式: 致瘤病毒可以在動物界以潛伏狀態(tài)廣泛存在，通過直接接觸感染或通過胎盤、乳汁感染子代。病毒誘發(fā)腫瘤與很多因素有關，如宿主的遺傳特征、性別、內分泌狀況、免疫狀態(tài)、年齡以及病毒的致癌強度等等。致瘤病毒的特征 (三)3、細胞轉化： 致瘤病毒在體外能使正常細胞轉化 轉化細胞的特征與體內腫瘤細胞相似。致瘤病毒在細胞內存在的形式：（1）完整病毒（2）僅有核酸，不能合成病毒外殼（3）僅有核酸，或部分核酸片段與細胞 核酸整合，不能產生完整病毒細胞感染病毒后的變化1、病毒繁殖：引起細胞裂解死亡，導致損害性疾病，多為急性； 2、整合：病毒核酸整合于細胞

17、核酸中，使細胞發(fā)生遺傳性改變，即轉化，導致增生性疾病，發(fā)生腫瘤；3、附加體：病毒核酸不整合到細胞核酸中，以附加體形式存在，可誘發(fā)腫瘤。 轉化細胞的特點1、形態(tài)與行為的改變：a. 梭形細胞圓化、增大、母細胞化；b. 對附著體的粘著力減弱，細胞相互間的走向失去正常規(guī)律性，失去接觸抑制(contact inhibition)，細胞重疊生長，可以懸浮生長，軟瓊脂生長(集落形成)，微腫瘤樣的細胞灶斑；c. 生長時減少對血清成分的需要，糖原酵解獲得能量。Figure 3.7b The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)正常細胞轉化細胞Figure 3.12

18、The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)軟瓊脂生長(集落形成)2、細胞表面結構變化： 糖運送加快，透明質酸成分增加，失去胞漿微絲狀物，出現胚胎抗原或病毒相關抗原等；3、非表面性的生化改變： 如釋放蛋白酶類，胚胎基因再行活化，激素產生異常等。4、若真正發(fā)生腫瘤原性轉化，接種到適合的動物宿主可形成腫瘤。研究人類(致瘤)病毒病因的技術方法1、活的宿主體系：（1）1892年Iwanowaski發(fā)現煙草花葉病毒以來，整株的植物就被用來研究植物病毒；（2）最初的動物病毒研究也是采用活體動物進行的，甚至采用自愿者進行人類病毒的研究。如狂犬病毒（兔）、黃熱病毒

19、（小鼠、自愿者）；（3）20世紀初，雞胚開始用于病毒的研究它不僅是第一個繁殖培養(yǎng)病毒和高效分離病毒的體系，還是第一個定量分析物病毒的體系。 該體系主要用于生產不能體外繁殖的病毒，研究病毒感染的病理作用，檢測疫苗安全性等。 缺點：成本高，出結果慢。 2、細胞培養(yǎng)：（1）建立腫瘤細胞株：研究細胞內是否病毒或病毒的痕跡；（2）細胞轉化試驗：鑒定分離的病毒是否具有致腫瘤的特性，如人EBV能使正常人的 B 淋巴細胞轉化成類淋巴細胞，轉化細胞帶有病毒基因，可連續(xù)傳代。 （3）細胞融合：將帶有病毒基因而無完整病毒的T 細胞，在滅活的仙臺病毒作用下與敏感細胞融合成雜交細胞，這樣可去除T 細胞內對病毒基因的抑制

20、作用，從而復活T細胞內的病毒。 （4）藥物激活腫瘤病毒：嘧啶類似物(正丁酸、TPA)可激活T細胞中的腫瘤病毒 3. 病毒癌基因轉基因小鼠如EB病毒癌基因LMP1轉基因小鼠淋巴瘤發(fā)生率高于對照小鼠。4. 用無胸腺小鼠建立人類腫瘤的移植瘤株如用無胸腺小鼠建立了人鼻咽癌的移植瘤株，該細胞株有 EBV 抗原和核抗原，移植瘤株的體外培養(yǎng)物有EBV顆粒出現，獲較純的上皮癌。Figure 3.13 The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)5、病毒超微結構的研究：（1）物理學分析方法：用不同孔徑的膠膜測定病毒粒子的直徑，粗略估量病毒粒子的大??；超速離心不僅可以

21、測得病毒的沉降系數，還為病毒的化學組成分析提供了樣品；分光光度計可以更簡便地測定病毒核酸/蛋白比率和物理學性質；電泳技術可從蛋白質和核酸分子水平分析病毒粒子的組成；X-射線晶體衍射技術可在分子水平上測定病毒的結構。（2）化學分析法：測量病毒的整體組分（原子組成），病毒蛋白和核酸的特性，測量病毒粒子的結構及包膜中各組分之間相互作用的方式。（3）電子顯微鏡技術：透射電子顯微鏡（TEM)：可以實現更大的放大功能。掃描電子顯微鏡（SEM)：可以得到美妙的三維外觀圖。5、血清學/免疫學方法：如CF，NT, IFA, 免疫擴散，免疫電泳，放射免疫、蛋白質雜交分析（Western-blot）等；6、流行病學

22、方法： 血清流行病學調查，研究病毒與腫瘤的關系；7、分子生物學與生物化學技術：如核酸雜交法發(fā)現鼻咽癌上皮細胞和鼻咽部非癌細胞有EBV基因；8、疫苗試用：阻斷作用。擬用EBV疫苗，預防和控制非洲兒童Burkitt淋巴瘤，是否可預防EBV感染和降低鼻咽癌發(fā)病率？確定病毒致癌作用必須具備以下五個條件：1、病毒感染在腫瘤發(fā)生之前；2、在腫瘤內找到病毒、病毒抗原及病毒核酸；3、體外培養(yǎng)的瘤細胞能產生相應病毒或病毒抗原；4、病毒能使正常細胞轉化為惡性細胞，并能在實驗動物中誘發(fā)癌瘤；5、用免疫措施預防病毒感染能降低腫瘤的發(fā)生率。EBV與鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma ,NPC)鼻咽

23、癌高發(fā)區(qū) 30/100,000 Southern China 1/10, most of other areasEBV:Genetic CantoneseEnvironmental:Diet Pollution SmokeCandidate NPC susceptibility loci:4p15.1-q123p21.35p13-156p21 (HLA locus, from 1975) 鼻咽癌的病因學D.P.Huang鼻咽癌EBERs染色EBERs染色H&E染色一、EB病毒生物學特性二、EB病毒感染的形式三、EB病毒在鼻咽癌中表達的基因及其功能四、EB病毒亞型及與鼻咽癌的關系五、EB病毒在鼻

24、咽癌診斷中的意義六、EB病毒在鼻咽癌治療中的意義EB病毒生物學特性人類皰疹病毒（gamma）亞類 (Human Herpes Virus 4雙鏈DNA（ddDNA virus）感染全世界90以上的成人原發(fā)性EB病毒感染為無癥狀感染，多發(fā)生在幼兒時期 原發(fā)感染發(fā)生在青春期后，則發(fā)生急性感染性單核細胞增多癥 人在原發(fā)感染后，則多終生攜帶病毒 電鏡下EBV病毒顆粒EB病毒感染細胞大體分為兩類：產病毒感染（又稱裂解感染）和潛伏感染 EB病毒感染的形式潛伏II期潛伏I期潛伏III期EB病毒與鼻咽癌鼻咽癌患者血清中存在高滴度的EBV抗體和高拷貝的EBV DNA片段癌組織存在EBV基因及表達產物從鼻咽癌癌組

25、織建立了攜帶EBV的裸鼠移植瘤株和相應的上皮細胞株EBV末端重復序列的分析表明，鼻咽癌起源于單個EBV感染的細胞，癌細胞的增殖發(fā)生在EBV的感染之后EBV在鼻咽癌發(fā)病中的作用What causes NPC為何鼻咽癌在廣東高發(fā)遺傳背景（Genomic background）特異性的EB病毒亞株Specific subtype of EBV (with higher tumorigenicity or/and lower immunogenicity)其他的致癌因素（Other environmental carcinogens）Why EBV infect over 90% of the adu

26、lt population worldwide, but the incidence of NPC varies according to geographic and racial background?LOWERHIGHERIs there a disease-associated subtype of EBV?是否存在疾病相關的EBV亞型？A typic Chinese EBV Strain Type A“c” : Loss of the BamHI restriction site between the W1 and II fragments“f”: gaining an extra

27、 site within BamHI FLost of an XhoI restriction site with the N-terminal of LMP1 gene 30 bp deletion in the C-terminal of LMP1EBNA1: V-valLMP1: China 1 aa 229 (Ser), 334 (Gln to Arg), 344 (deleted) Available whole genomic sequence: Only strain B95-8M-ABA, CC34-5, QIMR-WIL, et alIt is interesting and

28、 importantGenomic sequence analysis of several EBV strains from different geographic regions分析來源于不同區(qū)域EB病毒全基因序列，為鑒定疾病相關的EB病毒亞型具有重要意義 EBV from Throat Wash of NPC patient Immortalize lymphocytes (Umbilical cord blood mononuclear cells) Genomic DNA Long Distance PCR Shotgun Sequence鼻咽癌細胞株SUNE1中EBV-BARF0

29、 (S-BARF0)基因比B95-8中EBV-BARF0(B-BARF0)基因具有更強的致瘤能力軟瓊脂集落形成試驗裸鼠成瘤試驗EBV感染上皮細胞機制Lawrence Young, EBV40 years, nature reviewLawrence Young, EBV40 years, nature review2008 EBV meetingEB病毒感染B細胞首先通過病毒表面糖蛋白gp350/220與細胞補體受體CR2(CD23) 結合而黏附于B細胞，病毒gH、gL和gp42的糖蛋白復合體參與病毒進入細胞的過程，gp42與HLA II類抗原結合介導病毒進入細胞，而gH 則介導病毒與細胞的融

30、合。2008 EBV meeting？EB病毒感染上皮細胞研究表明淋巴細胞釋放的病毒容易感染上皮細胞，反之，上皮細胞釋放的病毒更容易感染淋巴細胞但EB病毒感染上皮細胞的機制尚未完全闡明上皮細胞不表達CR2，EB病毒感染上皮細胞無需gp350/220、gp42、CR2和HLA II，但可能需要BMRF2產物和細胞整合素的結合，或存在其它機制。 102EB病毒感染導致鼻咽癌的發(fā)病過程102EB病毒亞型鑒定感染（受體）受體？機制？癌變（通路）病毒癌基因細胞效應分子103 正常的鼻咽上皮細胞直接感染 感染效率極低鼻咽癌細胞GFP-EBV（EB病毒顆粒）感染效率極低1966：發(fā)現EB病毒與鼻咽癌相關EB

31、病毒如何感染鼻咽上皮細胞？癌變過程是否存在EB病毒易感的窗口期？104鼻咽癌前病變存在EB病毒感染假設正常癌前病變EBV感染 原位癌 浸潤性癌 轉移Kwok Wai Lo, et al, 2004體內惡性轉化侵襲/轉移正常鼻咽上皮細胞永 生 化EBV感染？Bmi-1體外p16hTERT105感染效率高但是，EB病毒易感上皮細胞不表達B細胞受體CD21 正常的鼻咽上皮細胞直接感染感染效率極低鼻咽癌細胞GFP-EBV（EB病毒顆粒）感染效率極低永生化細胞捕獲了EB病毒感染上皮細胞位于癌前病變階段的窗口期TASK: 鑒定介導EB病毒易感上皮細胞受體NRP1介導EBV的進入Nat Commun. 20

32、15 Feb 11;6:6240.72A1 (antibody to gp350)E1D1 (antibody to gH/gL) CL59 (antibody to gH)鼻咽癌中EB病毒表達基因EBNA1EBERsBARTsLMP1LMP2BARF1110通訊作者. PLoS Pathogens (病原學領域排名第一的雜志). 2010 IF 9.1明確LMP2A在鼻咽癌的細胞定位和致病機制研制及鑒定LMP2A新的單克隆抗體明確LMP2A定位于細胞膜發(fā)現LMP2A表達于90以上的鼻咽癌組織，且癌巢侵襲前沿發(fā)現LMP2A誘導上皮間質轉化(EMT)111誘導上皮間質轉化（EMT）EMT分子標志

33、遷移/侵襲能力曾木圣，通訊作者, PLoS Pathogens, 2010EMTLMP2A檢測到LMP2A誘導腫瘤干細胞特性 112誘導腫瘤干細胞特性（腫瘤發(fā)生轉移、治療耐受及復發(fā)的根源）自我更新的能力干細胞分子標記 SP細胞群體 成瘤能力曾木圣，通訊作者, PLoS Pathogens, 2010LMP2A誘發(fā)腫瘤起始細胞曾木圣，通訊作者, PLoS Pathogens, 20102008 EBV meetingLMP1通過PI3K, MAPK等通路調節(jié)癌細胞凋亡，促進癌細胞的存活，并通過NF-kB通路參與了鼻咽癌變 EB病毒游離DNA的檢測鼻咽癌患者血清EB病毒DNA的檢測首先報道于1998年之后Lo等