生物大分子物質(zhì)制備

1、關(guān)于生物大分子物質(zhì)的制備第一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月生命大分子物質(zhì)通常是指： 動物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時(shí)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(包括酶)和核酸等有機(jī)化合物的總稱。 生命科學(xué)研究將進(jìn)入后基因組時(shí)代。分離純化和測試分析蛋白質(zhì)技術(shù)顯得十分重要。 本章將以蛋白質(zhì)和核酸為主線討論其制備的一般過程，即材料的選擇與處理、測定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(這部分移至后面的章節(jié)介紹)等步驟。 第二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 材料的選擇與處理 一、材料的選擇 A.有效成分 是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其他物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。 第三

2、張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 B.有效成分在材料中存在的特點(diǎn)有效成分的含量一般較少 如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。有效成分穩(wěn)定性較差 大多數(shù)對酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感，易被微生物分解變質(zhì)。 選用的材料不同，有效成分的含量就不同； 選用的材料即使相同，但是部位或生長期不同，有效成分的含量也不盡相同。 第四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 C.材料選擇應(yīng)遵循的原則有效成分含量多、穩(wěn)定性好來源豐富、保持新鮮提取工藝簡單有綜合利用價(jià)值等 第五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、材料的處理 選擇到合適的材料后，應(yīng)及時(shí)使用，或采用冰凍或干燥

3、等方法處理。 同時(shí)還應(yīng)將易于去掉的非需物質(zhì)除去。 第六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 1 動物臟器 (1)冰凍 應(yīng)在很短時(shí)間內(nèi)置-10冰庫(可短期保存)或-70低溫冰箱(數(shù)月不變質(zhì))貯存。 脫脂 脂肪容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)，而且還會影響純化操作和制品得率。 一般脫脂的方法有： A.人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織； B.浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂； C.采用快速加熱(50左右)、快速冷卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去； D.利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。第七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2)干燥 A.丙酮液中脫水，干燥后磨粉貯存?zhèn)?/p>

4、用； B.在沸水中蒸煮處理，烘干后能長期保存。第八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 2 植物組織 A.葉片 用水洗凈即可使用； 或在l0h內(nèi)置-4-30冰箱貯藏備用。 B.植物種子 需泡脹或粉碎才可使用。 材料含油脂較多時(shí)，要進(jìn)行脫脂處理。 第九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 3 微生物 為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一。 用離心法收集到的上清液， 可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分； 可置低溫下短時(shí)間貯存。 收集到的菌體，經(jīng)破細(xì)胞處理后則可從中提取其他有效成分； 或制成凍干粉，在4保存(數(shù)月不會變質(zhì))。第十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 確立測定方

5、法 一、目的與要求 測定哪些材料含有目標(biāo)有效成分？ 哪些材料含量豐富？ 提純過程純度是否逐漸增加？ 要確立專一、準(zhǔn)確、靈敏和簡便的測定方法。 因?yàn)椋河行С煞衷谠牧现泻枯^低；底物要專一性的。第十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、常用的測定方法 1.光譜法2.電化學(xué)法3.生物活性檢測法4.免疫分析法5.生物傳感器第十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 1 光譜法(1)吸收光譜法直接測定法；比色法(2)熒光法(3)濁度法 特點(diǎn)： 測定時(shí)所需的樣品量較少，但往往能產(chǎn)生比較高的消光值； 且操作簡單，反應(yīng)迅速、靈敏； 結(jié)果也較準(zhǔn)確， 第十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年

6、6月 (1)吸收光譜法 直接測定法、比色法 直接測定法 將待測物(如核酸、蛋白質(zhì))配制成一定濃度的溶液后，移至相應(yīng)波長的分光光度計(jì)中， 即可從測定的消光值換算出待測物的含量。 第十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 A.測定核酸含量 構(gòu)成核酸的堿基組分是分光光度計(jì)測定核酸含量的依據(jù)。 在測定過程中，DNA或RNA溶液濃度的增加或降低，會使其在波長260nm的消光值(A260) 隨之增加或降低，二者之間成正比關(guān)系。第十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 通常1個(gè)A260值分別相當(dāng)于 雙鏈DNA 50gml 單鏈DNA 37gml 單鏈RNA 40gml 用A260A280比值

7、可確定DNA和RNA的純度： 純DNA比值為1.8 純RNA的比值為2.0 當(dāng)此比值分別小于1.8和2.0時(shí)，表明樣品中已污染了蛋白質(zhì)或酚類等物質(zhì)。 第十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 B.測定蛋白質(zhì)的含量及純度 蛋白質(zhì)(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由構(gòu)成蛋白質(zhì)組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值決定的，胱氨酸的貢獻(xiàn)很小。第十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 比色法 將待測物(如蛋白質(zhì)、核酸、糖類)與相關(guān)試劑(見表1-2)或酶的底物作用后，根據(jù)呈現(xiàn)的顏色或形成的產(chǎn)物特性，移至相應(yīng)波長的分光光計(jì)中，即可從測定的消光值換算出待測物的含量。 例如： 鄰苯二

8、酚(在275nm有吸收峰) + 鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶 黃色的- 羥基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰) 通過檢測375nm消光值的升高即可換算出所用酶的活力。 第十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 還可用不同消光值之間的比值鑒定某些物質(zhì)的純度 例如 純細(xì)胞色素c還原型A550氧化型A280比值為1.25 1.28。 假如比值過高或過低，就表明細(xì)胞色素C中污染了雜質(zhì)。 第十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2)熒光法 特點(diǎn)： 熒光法的精確性、重復(fù)性和靈敏度比吸收光譜法好。 當(dāng)分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測時(shí)，改用熒光法卻能求得滿意結(jié)果。 如： NAD(菸酰胺腺

9、嘌呤二核苷酸)（輔酶） NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（輔酶） 由于NADH2和NADPH2發(fā)熒光，用于偶聯(lián)NADH2 (或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的還原反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行熒光測定。 第二十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 例子： 谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力測定采用與蘋果酸脫氫酶（MDH)相偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行。 天冬氨酸 +- 酮戊二酸 GOT 草酰乙酸 + 谷氨酸 草酰乙酸 + NADH+H+ MDH L - 蘋果酸+NAD+每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH，這樣GOT活力就可通過測定NADH在340nm消光值的下降來求得。 第二十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2

10、022年6月 (3)濁度法 極稀的懸浮液可采用此法測定，即測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。 例如 伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力測定方法之一就是采用此法(A420)。 培養(yǎng)液中細(xì)菌生長的濃度(A600) 也可用此法測定。第二十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 2 電化學(xué)法 有些反應(yīng)過程會放出質(zhì)子氫(H+)，可用靈敏的pH計(jì)或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計(jì)算出欲測物的含量或活力。 例如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定該酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。 第二十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 3

11、 生物活性檢測法 大多數(shù)生命物質(zhì)，尤其是一些激素類物質(zhì)，當(dāng)把它們注射入動物的特定器官時(shí)，所屬機(jī)體將發(fā)生相應(yīng)的變化，并且二者間有一定的相關(guān)性。根據(jù)這一性質(zhì)設(shè)計(jì)的方法，即可對生命活性物質(zhì)進(jìn)行檢測。 如：在某個(gè)動物器官中注射某種激素，使器官細(xì)胞加速分裂，通過檢測細(xì)胞的數(shù)量變化來推測激素的生物活性。第二十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 4 免疫分析法 采用抗體與抗原之間發(fā)生的特異反應(yīng)，并結(jié)合放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記，就可對有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行靈敏的定性或(和)定量分析(詳見第十九章)。 5 生物傳感器 用生物傳感器中的敏感膜（具有分子識別功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗體、生物膜和微生物等作為敏

12、感元件）與待測溶液中的某一物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，即可通過顯示器反映出有效成分的數(shù)量(詳見第十七章)。 第二十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 細(xì)胞的破碎 細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。 有效成分可以分泌于細(xì)胞外，也有存在于細(xì)胞內(nèi)的。 如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培養(yǎng)液中，用適當(dāng)?shù)娜軇┛芍苯犹崛　?存在于細(xì)胞內(nèi)的酶又有游離酶和結(jié)合酶之分，前者游離在細(xì)胞質(zhì)中，后者則與細(xì)胞器緊密結(jié)合(如氧化還原酶和有機(jī)磷水解酶等)。 第二十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月欲提取存在于細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)時(shí)，必須把細(xì)胞破碎（個(gè)別的則例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。動物臟器的細(xì)胞膜比較脆弱，

13、極易破損，往往在組織絞碎或提取時(shí)就被破壞了。植物和微生物的細(xì)胞壁較牢固，需要在提取前進(jìn)行專門的破細(xì)胞操作。第二十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、機(jī)械破碎1 研磨法剪碎的動物組織置研缽中，用研磨棒研碎。 用勻漿器處理，也能把動物細(xì)胞破碎。 大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用電動研磨法。 細(xì)菌和組織的細(xì)胞破碎均可用此法。 2 組織搗碎器法這是一種劇烈的破碎細(xì)胞方法。搗碎器(8 00010000r/min)處理3045s，植物和動物細(xì)胞能完全破碎。 第二十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3 超聲波法 它是借助聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。 4 壓榨法 此法是一種溫和、徹底破碎

14、細(xì)胞的方法。 用1.771083.54108Pa的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔(20kDa)或甘油中。 10ml抽提液可在1h內(nèi)濃縮到幾乎無水的程度。 這種方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數(shù)量有密切關(guān)系。 B.真空透析 第四十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、減壓蒸餾法當(dāng)真空度較高時(shí)溶液的沸點(diǎn)可控制在30以下。 這種方法一般適用于常溫下穩(wěn)定性好的物質(zhì)。第四十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 六、冰凍干燥法 冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下，可以由固體直接變?yōu)闅怏w。用此原理進(jìn)行濃縮，有效成分幾乎不會破壞。 凍干機(jī) 凍干機(jī)主要由：低溫干燥箱、真空泵和冷凍機(jī)構(gòu)成。

15、 第四十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 純化方案的設(shè)計(jì)與評價(jià) 純化方案： 是指在純化某一物質(zhì)過程中，將幾種分離方法(如沉淀法、離子交換層析、葡聚糖凝膠等)有機(jī)地互補(bǔ)聯(lián)合、靈活應(yīng)用的總稱。 第四十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、純化方案的設(shè)計(jì) 依據(jù)抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異性，從諸多方法中挑選出兩種、兩種以上乃至更多種分離方法組成一個(gè)純化方案。 各分離方法的排布： 一般地， 先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工序處理的方法； 后選用精確、費(fèi)時(shí)和需樣品量少的方法。第四十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、純化方案的評價(jià) 對純化

16、方案的評價(jià)，實(shí)質(zhì)上是對組成純化方案的每一種分離方法的評價(jià)。 這種評價(jià)僅采用理論分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，只有經(jīng)過實(shí)踐檢驗(yàn)才能正確得出。 第五十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 方法：純化過程的每一步收集到的溶液要進(jìn)行：有效成分的含量測定； 并計(jì)算：比活力(活力單位數(shù)毫克蛋白)純化倍數(shù)(每步的比活力粗抽提液的比活力)收得率(每步的總活力/粗抽提液總活力）100 視純化倍數(shù)的大小，收得率的高低，就能初步確定每種分離方法的應(yīng)用價(jià)值。第五十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一般認(rèn)為：凡是在特定實(shí)驗(yàn)中能增大純化倍數(shù)和提高收得率的方法均屬有應(yīng)用價(jià)值的。反之，則應(yīng)用價(jià)值不大，也不宜采用。 但是，

17、在純化過程中，隨著純化倍數(shù)的增大，有效成分的含量卻是逐漸減少，收得率也往往100(除非抽提液中存在酶的抑制)。 因此，實(shí)踐中對純化倍數(shù)和收得率的要求是根據(jù)材料來源的難易而變化的。若材料來源難，就希望提高收得率；反之，則希望提高純化倍數(shù)(見沉淀法)。 第五十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 例子 以從賽氏桿菌(Serratia sp)提取L-門冬酰胺酶為例，說明純化方案與純化倍數(shù)和收得率的關(guān)系(見表1-7)。第五十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月表1-5 L-門冬酰胺酶的純化比活力 = 活力單位數(shù)毫克蛋白純化倍數(shù) = 每步的比活力粗抽提液的比活力收得率 = 每步的總活力/

18、粗抽提液總活力100步驟 總蛋白/g 總活力/u 比活力（u/mg） 純化倍數(shù) 收得率/%1.粗抽提液 30 21000 0.7 1 100 2.氯化錳處理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰凍融解 5.58 14872 2.7 3.8 714.DEAE-纖維 0.113 5025 44.5 63.5 24 素層析5.硫酸銨鹽析 0.048 3367 71.7 102.0 176.羥基磷灰石 0.016 3133 200.0 286.0 15 柱層析7.PAGE 0.012 3100 255.0 365.0 15第五十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月此處，酶含量是用活力單位表示 酶純度用比活力表示 純化的有效成分不同，表示其含量和相對純度的單位亦不一樣。 如純化的物質(zhì)是胰島素，其含量將用效價(jià)表示，純度用每毫克蛋白質(zhì)所含效價(jià)單位表示。 第五十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 有效成分純度和性質(zhì)的分析 在實(shí)踐中 常用于鑒定生物制品純度的方法有：電泳(見第十八章)、免疫分析(見第十九章)、薄層層析和薄膜層析(見第三章)等。 用于檢測其含量和性質(zhì)的方法有：光譜法和氣相層析(見第二十章)等； 用于測定有效成分分子質(zhì)量的方法有：凝膠過濾(見第六章)和電泳法等； 用于測定核酸序列的方法有：化學(xué)直讀法、酶解直讀法(見第十三章)等； 用于測定