組培防止滅菌的方法

1、淺談植物組織培養(yǎng)中如何預(yù)防細(xì)菌污染的技術(shù)摘 要:植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常出現(xiàn)不同程度的污染問(wèn)題，造成很大的損失，因此預(yù) 防細(xì)菌污染是植物組織培養(yǎng)苗工廠化生產(chǎn)中重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文通對(duì)植物組織 培養(yǎng)污染來(lái)源的分析和控制，淺析了如何在植物培養(yǎng)中預(yù)防何控制細(xì)菌的污染， 以達(dá)到植物組織培養(yǎng)的最優(yōu)化。關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)污染防治刖言：植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興技術(shù)， 這項(xiàng)技術(shù)已在科研和生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，成為舉世矚目的生物技術(shù)重要內(nèi)容 之一。特別是近幾年，不少組織培養(yǎng)工廠應(yīng)用該技術(shù)大量生產(chǎn)花卉、蔬菜及特 種經(jīng)濟(jì)植物幼苗、脫毒苗，使作物種植逐步擺脫周期長(zhǎng)、完全受自然控制的分 散

2、狀態(tài)，逐步走向集中控制、規(guī)?；⒆詣?dòng)化、不受自然影響的工廠化生產(chǎn) 【1】盡管組織培養(yǎng)方面理論研究已相當(dāng)精深，但在預(yù)防細(xì)菌污染中還存在種種的 問(wèn)題，因此介紹和討論了組織培養(yǎng)中的污染原因及其對(duì)策。植物組培苗工廠化生產(chǎn)在我國(guó)發(fā)展速度很快，組織培養(yǎng)各方面的技術(shù)日漸 完善。但在組織培養(yǎng)中常常出現(xiàn)不同程度的污染。據(jù)了解，很多學(xué)者在初代培養(yǎng) 這一階段，很難得到無(wú)菌苗，或者雖然在初代培養(yǎng)得到了無(wú)菌苗，但在繼代培養(yǎng) 時(shí)往往出現(xiàn)大量污染甚至全部污染。在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中，如何降低成本是提高經(jīng)濟(jì)效 益的首要問(wèn)題，組織培養(yǎng)中污染率的增加勢(shì)必然引起組培苗成本的提高，經(jīng)濟(jì)損 失大。因此，組織培養(yǎng)中降低污染率是工廠化生產(chǎn)中不可忽視

3、的技術(shù)環(huán)節(jié)。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，存在兩種類型的污染：一類是通常所說(shuō)的污染， 即外植體消毒不徹底，無(wú)菌操作和培養(yǎng)過(guò)程中，如：培養(yǎng)基、接種工具、接種室 消毒不嚴(yán)格或操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染；另一類是內(nèi)源菌污染，內(nèi)源菌包括真菌 和細(xì)菌，內(nèi)源污染一般是指內(nèi)源細(xì)菌所致的污染。本文主要探討了如何預(yù)防細(xì)菌 的污染。1細(xì)菌污染簡(jiǎn)介1.1污染的原因污染的原因在培養(yǎng)過(guò)程中污染是經(jīng)常發(fā)生的。它會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料 上滋生雜菌，最終組培失敗。在科研和商品化生產(chǎn)種苗中，污染率是與經(jīng)濟(jì)效益 緊密相關(guān)的一個(gè)重要指標(biāo)，控制污染率無(wú)疑是一項(xiàng)提高經(jīng)濟(jì)效益、節(jié)約材料的 有效途徑之一。因此，探討和重視污染在科研和生產(chǎn)中顯得十分重要

4、。1.2操作污染和環(huán)境污染操作污染和環(huán)境污染指真菌污染和細(xì)菌污染。真菌污染主要來(lái)源于環(huán)境， 細(xì)菌污染主要來(lái)源于接種材料及工具。此類污染可通過(guò)如下措施加以克服： 1.2.1改善環(huán)境條件每次接種前應(yīng)對(duì)接種室的地面進(jìn)行清潔衛(wèi)生工作，并用75%的酒精噴霧使空 氣中的灰塵沉降，并用紫外線燈在黑暗中照射2030分鐘。接種前工作臺(tái)面要用 新潔爾滅或75%酒精擦洗，使用超凈工作臺(tái)對(duì)接種環(huán)境污染的控制更有成效。但 它應(yīng)置放在潔凈的房間，窗戶密封，并定期清洗過(guò)濾膜，以延長(zhǎng)使用壽命。培養(yǎng) 室的相對(duì)濕度應(yīng)控制在70%左右，相對(duì)濕度太高時(shí)可以用抽濕機(jī)除濕。在接種結(jié) 束時(shí)，應(yīng)進(jìn)行地面清潔衛(wèi)生工作，即先打掃一遍，再用濕布擦

5、過(guò)，并定期用甲醛 熏蒸接種室。1.2.2無(wú)菌操作和無(wú)菌操作技術(shù)工作人員使用的工作服、帽子、口罩等，要經(jīng)常保持干凈，并定期進(jìn)行消毒。 在接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗，最好再在新潔爾滅溶液中浸 泡10分鐘，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母種瓶表面進(jìn)行消毒，以 防把微生物帶進(jìn)超凈工作臺(tái)。同時(shí)要求工作人員在接種時(shí)，最好不要感冒咳嗽和 說(shuō)話。污染中特別注意一種呈乳白色的細(xì)菌污染，這種細(xì)菌為芽孢桿菌。法國(guó)林 木育種協(xié)會(huì)鑒定為遲緩芽孢桿菌，它外被莢膜，耐高溫，一般消毒劑難以殺死。 它可隨培養(yǎng)材料、用具等傳播；也可出現(xiàn)在培養(yǎng)基表面，或呈滴形云霧狀存在培 養(yǎng)基內(nèi)，若出現(xiàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格滅菌，清

6、洗和消毒用具，并更換消毒酒精。操作人員操作動(dòng)作要熟練、動(dòng)作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時(shí)間，減少 污染。因?yàn)橛泻芏嘟M織培養(yǎng)的失敗，從材料、培養(yǎng)基條件等方面檢查均無(wú)問(wèn)題， 只是由于操作技術(shù)不熟練，如脫毒培養(yǎng)抽取莖尖很小，操作時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)使莖尖 失水變干，或不慎感染雜菌，再同時(shí)接種的環(huán)境又不是絕對(duì)無(wú)菌的。1.2.3嚴(yán)查接種材料淘汰被細(xì)菌污染過(guò)的接種材。1.2.4經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量消毒鍋的壓力表降到零后不能馬上出鍋。因冷熱空氣作用的負(fù)壓效應(yīng)，使外 界環(huán)境的冷空氣倒吸入已滅菌好的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)引起真菌污染，為避免該現(xiàn)象的發(fā) 生，消毒后培養(yǎng)瓶應(yīng)留在鍋里，等冷卻后才出鍋。如果出現(xiàn)培養(yǎng)基造成的污染， 就要及時(shí)

7、地檢查滅菌鍋的性能或其他的問(wèn)題。1.2.5檢查培養(yǎng)容器是否存在問(wèn)題培養(yǎng)容器封口多用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等，塑料蓋用久了易老化，密 封性差，也會(huì)造成污染。同時(shí)，培養(yǎng)瓶在使用之前要洗凈（包括瓶?jī)?nèi)瓶外），滅 好菌的培養(yǎng)瓶不要放在空氣中太久，一般出鍋后12天內(nèi)接完種最好，以減少培 養(yǎng)瓶表面的微生物引起的污染。2 內(nèi)源性污染的控制2.1內(nèi)源性污染的含義在植物組織培養(yǎng)中，由于材料內(nèi)部的內(nèi)生菌不能被一般的表面消毒方法所 清除，隨著材料進(jìn)入培養(yǎng)過(guò)程，引起的污染稱為內(nèi)生性污染或內(nèi)源性污染。2.2內(nèi)源性污染的種類從已有報(bào)道看，被鑒定的種類主要有：黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌 屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬、歐

8、文氏菌屬等。真菌主要有霉菌。目前在各種農(nóng) 作物及果樹(shù)等經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超過(guò)129種（隸屬于54個(gè)屬）對(duì)于 一種植物而言，從中分離到的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌通常為數(shù)種至十種，有的還到 百種之多，其主要出現(xiàn)在熱帶植物組織中。2.3內(nèi)源性污染的分布內(nèi)源性污染主要發(fā)生在那些生長(zhǎng)在高溫多雨的熱帶、亞熱帶和多年生木本植 物，尤其是在污染較嚴(yán)重的地區(qū)，如工業(yè)區(qū)，人口眾多的城市，公路邊等。2.4內(nèi)源性污染的癥狀和危害性在初代培養(yǎng)中，表面細(xì)菌引起的污染通常在23天就能在外植體周?chē)蚺囵B(yǎng) 基表面形成明顯的如水污狀、油污狀、氣泡或十縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落。而在外植體培養(yǎng)后35天內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染，以后則

9、不繼出現(xiàn)明顯的或不明顯 的細(xì)菌菌落，就可能是由內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。在某些植物初代培養(yǎng)或前幾代的繼代培養(yǎng)中存在的污染，并不形成明顯的菌 落而只在培養(yǎng)基內(nèi)部形成“絲狀物”，“暈狀物”，不易被肉眼發(fā)現(xiàn)的，如不仔 細(xì)觀察很容易忽視，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，菌量不斷的積累，就會(huì)在培養(yǎng)基 上表現(xiàn)出來(lái)。對(duì)于這種情況，我們可以利用背光檢查法去觀察發(fā)現(xiàn)它。內(nèi)生細(xì)菌引起的危害主要包括在早期導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，增殖效率降低，培養(yǎng) 物生長(zhǎng)減慢，玻璃化苗增多等。在后期導(dǎo)致試管苗移栽困難或死亡，有時(shí)污染也 會(huì)引起培養(yǎng)物的遺傳變異。3細(xì)菌污染的防止措施3.1外植體的消毒3.2.1預(yù)栽管理一般來(lái)說(shuō)，溫室內(nèi)盆栽的植株比室外栽培的植株

10、含菌少，為了能更好的降低 污染率，我們要把室外栽培變?yōu)槭覂?nèi)盆栽。要求：盆栽用土應(yīng)使用不含有機(jī)質(zhì)及 經(jīng)消毒的清潔土壤，尤其是要采集地下材料時(shí)，須用經(jīng)過(guò)消毒蛭石等作栽培基質(zhì)； 施用無(wú)機(jī)肥，并對(duì)植物噴灑殺蟲(chóng)劑和殺菌劑。不便移栽的，可套塑料袋，待長(zhǎng)出 新枝條后，再采樣接種。3.2.2外植體預(yù)處理3.2.2.1促發(fā)新枝將田間采集的枝條用水沖洗干凈后插入無(wú)糖的培養(yǎng)液或自來(lái)水中，使其發(fā) 枝，后以這種新抽的嫩枝作為外植體，可大大減少內(nèi)源菌的污染。3.2.2.2黃化處理在無(wú)菌條件下，對(duì)采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待抽出徒長(zhǎng)的黃化枝條時(shí)取 材，也可減少污染。這方法曾用于成年栗樹(shù)的枝條和仙客來(lái)實(shí)生苗，減少了內(nèi)生 細(xì)菌

11、的污染。3.2.2.3熱擊處理如將美麗百合的鱗莖外植體放入試管中進(jìn)行43聶氏度熱擊處理，羅伯利械 的休眠芽進(jìn)行42.5聶氏度或45聶氏度熱擊處理；草莓莖尖在30聶氏度處理可 得到脫毒苗。3.2.2.3用抗生素進(jìn)行處理慶大霉素和鏈霉素，屬于氨基糖苷類型，它們與細(xì)菌中的30S核蛋白體亞單 位結(jié)合，抑制細(xì)菌的酸苷油酯合成，通過(guò)阻斷其正常代謝途徑使微生物致死。如 相思樹(shù)的莖段滅菌時(shí)，用皂液刷洗和75%酒精殺菌后，轉(zhuǎn)入不同的抗生素溶液中， 在搖床上振蕩過(guò)夜，再用75%的酒精和0.1%升汞分別殺菌1分鐘和15分鐘，滅 菌效果（如下表）其中以抑制劑ANB1和ANB2的抑制效果較好，未污染的分別為 63.3%

12、和76.7%；成活率分別為60.0%和50.0%。不同抗生素預(yù)處理對(duì)相思樹(shù)莖段的影響處理接種莖段數(shù)未污染的成活的莖段數(shù)比例（）莖段數(shù)比例（）ANB1301963.31860.0ANB2302376.71550.0頭孢拉定300000.0林肯霉素30723.3516.7慶大霉素301550.0826.7對(duì)照CK3026.713.33.2.3改進(jìn)滅菌方法3.2.3.1真空減壓滅菌利用真空減壓抽走植物組織中的空氣，使消毒劑容易侵入，從而增強(qiáng)殺菌效 果。經(jīng)對(duì)萬(wàn)年青莖段的實(shí)驗(yàn)可知道:減壓滅菌的效果明顯優(yōu)于常規(guī)滅菌（如下表）， 未污染率從常規(guī)的6.7%升到60.0%，成活率從常規(guī)的3.3%升到43.3%。

13、常規(guī)滅菌與真空減壓來(lái)滅菌對(duì)萬(wàn)年青莖段防止效果比較處理接種莖段數(shù)未污染的成活的莖段數(shù)比例（）莖段數(shù)比例（）常規(guī)滅菌3026.713.3減壓滅菌302860.01343.33.2.3.2磁力攪拌、超聲波振動(dòng)法為減少在外植體表面形成的氣泡，在浸泡時(shí)還可采用磁力攪拌和超聲波振 動(dòng)的方法。如對(duì)月季、蘋(píng)果的枝條，用0.1升汞磁力攪拌1520分鐘，再用無(wú)菌 水磁攪拌清洗，污染率有所下降。3.2.3.3灼燒滅菌利用火燒的方法殺死外植體表面的所有微生物，以不傷害所要使用的組織 或細(xì)胞為度。如將馬蹄蓮的根在95%的酒精中浸泡1分子鐘后，短時(shí)間內(nèi)灼燒2 次，比常規(guī)消毒的污染率降低60%。這種方法已用在綠色莢果、蒜的

14、小鱗莖和銀 白楊芽的消毒。3.2.3.4酸化培養(yǎng)基除了歐文氏菌屬外，大多數(shù)細(xì)菌在介質(zhì)PH小于4.5時(shí)不能生長(zhǎng)。在紫苑屬、 鳶尾屬、薔薇屬植物組織中，將培養(yǎng)基的PH5.8降到3.94.3，可防止大量的細(xì) 菌污染。3.2.3.5 其他多次消毒如先用皂液對(duì)番木瓜側(cè)芽浸泡2030分鐘，再用0.1%高錳酸鉀溶 液處理5分鐘，然后進(jìn)行消毒處理，然后用4%次氯酸鈉加0.1%升汞消毒，最后 用無(wú)菌水洗，污染率降低為50%左右；使用混合消毒液是用幾種消毒液（如多菌 靈、抗壞血酸、檸檬酸、氯霉素等混合）對(duì)外植體時(shí)行處理，以降低污染率；在 培養(yǎng)基中加入其他抑菌劑（如50%多菌靈、70%甲基托布津和25%甲霜靈）抑菌

15、率 也非常高。3.2.4繼代培養(yǎng)中污染的控制初代培養(yǎng)獲得的無(wú)菌材料在后期或繼代培養(yǎng)也可能出現(xiàn)污染，這一方面是由 于操作不慎的原因，另即是由于初代培養(yǎng)中使用了營(yíng)養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基有可能 使污染不易表現(xiàn)出來(lái)，有時(shí)繼代材料在培養(yǎng)室則可能被螨傳播的真菌污染。這類 污染可以從以下2個(gè)方面進(jìn)行防止。（1）擴(kuò)大繁殖時(shí)應(yīng)有合理程序。在獲得的無(wú) 菌培養(yǎng)物之后，應(yīng)將其中一部分作為“原種”保存起來(lái)，分批繁殖和復(fù)檢后再大 規(guī)模生產(chǎn)。（2）可通過(guò)在培養(yǎng)基中加入抗菌劑來(lái)防止。多菌靈用于金線蓮組織 培養(yǎng)的抑菌促生長(zhǎng)，培養(yǎng)物不受微生物污染，滅菌率為98%以上，無(wú)白化苗，生 長(zhǎng)健壯，不過(guò)這種方法不能廣泛使用，因?yàn)橛行┲参镌谝志?/p>

16、素會(huì)受到毒害，如葉 片變小、變黃和不能分化等。還有使用時(shí)要調(diào)到適合的濃度。對(duì)植物中的內(nèi)生細(xì)菌，由于它潛伏得較深，表面消毒方法無(wú)法將其消滅。 有時(shí)在外植體的初級(jí)培養(yǎng)中，包括前幾代的繼代培養(yǎng)，往往在培養(yǎng)基上不易被發(fā) 現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，菌量慢慢累積發(fā)展，才在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來(lái)?？赏ㄟ^(guò) 在培養(yǎng)基中添加抗菌素，降低PH值等措施防止和減少細(xì)菌等內(nèi)生菌的污染。植物材料中的內(nèi)生菌，也可采用反復(fù)莖尖培養(yǎng)或分生組織培養(yǎng)的方法來(lái)脫 除。因致病菌在植物體內(nèi)的分布不均，且是通過(guò)維管束傳播的，故莖尖分生組織 是不帶菌的。因此，通過(guò)反復(fù)的莖尖培養(yǎng)和分生組織培養(yǎng)，既可脫內(nèi)生菌又可脫 毒。3.2.5減少培養(yǎng)基中的有機(jī)成分培

17、養(yǎng)基中有機(jī)成分的存在是污染產(chǎn)生的重要原因，去除有機(jī)物是減少污染 的一條途徑。在阿月渾子的組織培養(yǎng)中，除去培養(yǎng)基中的VB1、VB6、煙酸等（保 留肌醇）有機(jī)成分，經(jīng)23代培養(yǎng)后，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)叢生芽生長(zhǎng)增殖沒(méi)有 影響。原因是這些都是某些細(xì)菌生長(zhǎng)的必須物質(zhì)，去除這些有機(jī)成分后，細(xì)菌無(wú) 法生長(zhǎng)發(fā)育而慢慢死亡或減少。經(jīng)試驗(yàn)，在羅漢果生根培養(yǎng)中，除去糖成分，在 羅漢果苗生根時(shí)，可適當(dāng)加強(qiáng)光照，同時(shí)在接種時(shí)，要適當(dāng)?shù)亓粢恍┬∪~片，但 不能讓葉片接觸到培養(yǎng)基，生根苗的生長(zhǎng)都良好。由日本的古在豐樹(shù)教授首創(chuàng)的 無(wú)糖組織快繁技術(shù)則全部除去培養(yǎng)基中的有機(jī)成分，輸入可控制量的CO2氣體作 為碳源，并通過(guò)控制環(huán)境因

18、子，促進(jìn)植株光合作用速率，使之由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變成自 養(yǎng)型，因而植物長(zhǎng)勢(shì)良好，污染率明顯降低。4總結(jié)在植物組織培養(yǎng)中，一般的污染較容易控制，要達(dá)到接種的無(wú)菌環(huán)境條件，無(wú)菌 操作要求和無(wú)菌操作水平。而內(nèi)源菌則較難控制，要求全部殺死植物表面和組織 中的微生物，一般的消毒方法是不能完成的。通過(guò)先對(duì)外植體植物進(jìn)行預(yù)栽管理、 外植體的預(yù)處理，并在這基礎(chǔ)上，改進(jìn)消毒方法，(如真空減壓法、酸化培養(yǎng)基、 灼燒法等)，也可除去培養(yǎng)基中的有機(jī)成分，這些措施都能降低由內(nèi)源菌引起的 污染。當(dāng)然，在植物組織培養(yǎng)中，控制污染的方法是可靈活多變的，只要能減少 污染，不會(huì)發(fā)生培養(yǎng)物的遺傳變異，實(shí)現(xiàn)工廠化快繁，降低成本，能在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng) 中占有一席之地即可。參考文獻(xiàn)：1吳洪生.組織培養(yǎng)中的染菌及預(yù)防J藥物生物技術(shù),2001 ,8(2):23-25