免疫細胞化學實驗技能總結概要課件

1、免疫化學相關實驗技能1、定義用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。2、原理根據(jù)抗原抗體反應和化學顯色原理,組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發(fā)生的抗原抗體反應產(chǎn)物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。常用的標記物有熒光素、酶和

2、放射性同位素：標記熒光素的稱為免疫熒光法，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(rhodamine)等。標記酶的稱為免疫酶法，常用的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)等。標記同位素的稱為放射免疫法，常用的同位素有3H、14C、32S和31P等。 二、免疫酶/免疫熒光三、酶聯(lián)免疫吸附試驗一、石蠟切片/冰凍切片講解提綱（1）石蠟切片的制作 蒸餾水洗滌2遍二甲苯約20min、二甲苯/石蠟(1:1) 30min,純蠟、各30min常規(guī)石蠟切片，切片厚度為7 m50、 70 、80酒精各15 min ，95酒精、各15 min， 無水乙醇 、各15 min，無

3、水乙醇/二甲苯(1:1) 15 min于干凈載玻片上進行展片，37烤干取材、固定酒精脫水洗滌展片、烤片包埋、切片透明、浸蠟根據(jù)不同的實驗目的，選擇相應的材料，材料要求新鮮、準確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。所采集材料應立即放入固定液，并編號，注明采集時間、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。如：角膜、TE-HC等組織材料 細胞材料 肝臟、魚卵 取材 取材后，應立即進行固定。固定是制片極為關鍵的一個步驟，制片質量的優(yōu)劣除與材料的新鮮程度有關外，還取決于最初的固定是否適當和完全。固定的意義 新鮮的組織被割取后,由于細胞內酶的作用和細菌的繁殖，可引起

4、組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應立即采用一種方法將組織盡可能保持原有的形態(tài)結構，且有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。固定固定的目的和作用在于：防止組織自溶和腐??；使細胞內的蛋白質、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細胞的各種組成成分使其保持與生活時相近似的形態(tài)和結構；因沉淀及凝固的關系，使細胞內不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學上的差別，使原來在生活情況下看不清楚的結構變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細胞各部易于染色；固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。 名稱10%甲醛4%多聚甲醛苦味酸冰醋酸鋨酸固定效果好好沉淀

5、一切蛋白對染色質固定好好組織收縮大小大小小主要用途常規(guī)病理切片免疫化學不單獨使用不單獨使用-核型電鏡缺 點長期用其固定的組織變?yōu)樗嵝圆焕谌旧貏e是細胞核的著色固定的時間不宜太長，以24小時以內為宜滲透力弱，對組織收縮大使組織膨脹，一般不單獨使用價格昂貴；有毒混合固定劑（1）Bouin氏固定液：為常用的良好的固定劑，穿透速度快，組織收縮性較小，固定均勻，固定后組織有適當?shù)挠捕?，對于切片和染色均有良好的效果。一般固?224小時，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黃色，在脫水時經(jīng)各濃度酒精也可洗去黃色。（2）Carnoy液：滲透力強，特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細微的結構。顯示DNA

6、、RNA效果良好。（3）改良Bouin氏固定液：此液對一般組織固定效果都很好，固定時間為418小時，固定后直接放70%乙醇脫水，固定時間較長對組織亦無損害。固定時應注意的事項（1）固定液及被固定的組織必須新鮮；（2）固定液的用量一般為組織體積的1020倍，容器不要過小，材料也不要太多；應避免組織緊貼瓶底或瓶壁，以免影響固定液的滲入；（3）固定時間視組織塊的種類、性質、大小，固定液的種類、性質、滲透力的強弱，固定時的溫度的高低，實驗目的等；（4）固定所用的固定液，以新配的為好，放置過久會失效；（5）在固定期間搖動組織或搖動容器有利于固定液的滲入，對長期固定的標本，可經(jīng)常更換固定液;（6）取材固定

7、應同時作好記錄，包括組織名稱、固定液和時間等內容。乙醇：高濃度的酒精對組織有強烈收縮及脆化的缺點，因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水，而必須經(jīng)過由低到高的一系列不同濃度的酒精，逐漸取代組織中水分，以保證組織脫水徹底，并避免組織過度收縮和硬化。脫水注意事項： （1）脫水的時間應根據(jù)組織塊的大小和組織的類型而定。 （2）組織塊在高濃度，特別是無水乙醇內不能放置的時間太長。無水乙醇吸水能力太強，容易造成組織塊的過度硬化，使得切片病理組織易碎裂。 （3）在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%80%的酒精中。 （4）每次更換新的脫水劑時（組織塊從低濃度到高濃度），都要把組織塊放在吸水紙上吸干，以免將水

8、及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中，影響脫水效果。置換組織內的脫水劑，為下一步的浸蠟起到橋梁作用； 二甲苯：是現(xiàn)在應用最廣的一種透明劑，價格較便宜，不能和水混合，遇水則變成乳白色渾濁，因此必完全脫水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蠟，透明力強； 其最大的缺點是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不能在其停留過久，透明時間視組織塊的大小、性質而定；有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因組織過硬不易切片；長時間接觸，對粘膜有刺激作用。透明（1）浸蠟的目的 置換組織中的透明劑，為包埋做準備。 （2）注意事項 溫箱中的溫度必須嚴格控制在60的范圍，不能超過60；浸蠟時間不宜

9、過長。 浸蠟溫度過高或時間過長使組織收縮過度收縮和脆變。浸蠟（1）步驟 準備包埋蠟：一般應用硬蠟（5658或6062），所用的石蠟要求透明無雜質，新的石蠟要反復熔凝，并有一定的粘韌性。包埋用過的石蠟可以反復使用。 準備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。 點燃酒精燈，準備好無齒尖鑷子，需作標記應先寫好標簽。 在包埋框中倒入硬蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向。包埋框或紙盒內的蠟逐漸凝結，若表面已凝結形成一層固體狀，即可放入冷水中，加速其凝固。 待蠟塊完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆開紙盒，取出蠟塊。 包埋（2）注意事項 包埋時夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時燒熱，以免石蠟凝結

10、后粘附在鑷子上，造成蠟塊凝固不均勻。 包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時間應盡量縮短。 包埋后的蠟塊應呈均質半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組織的底部，應考慮這樣幾個方面的問題：a. 脫水不徹底。b.包埋蠟溫度低了，組織進行包埋時，包埋框中的蠟已成凝結狀。c.組織內還殘留有較多的透明劑。d.石蠟不純。 包埋箱中的溫度必須保持恒定。 如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋。 較小的組織可在脫水透明時開始用伊紅染色 包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉式切片機的蠟塊鉗內，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。 切片刀的

11、銳利與否、蠟塊硬度適當都直接影響切片質量，可用熱水或冷水等方法適當改變蠟塊硬度。通常切片厚度為47微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。切片 用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是甘油蛋白。 首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層甘油蛋白，再將一定長度蠟帶（連續(xù)切片）或用刀片斷開成單個蠟片于溫水（45左右）中展平后，撈至玻片上鋪正，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45溫箱中干燥，也可在37溫箱中干燥，但需適當延長時間。展片缺 點：材料發(fā)生裂隙破碎或脫落原 因：1脫水不干凈2有透明劑殘留3石蠟透入時，溫度過高或時間過長4由于脫水劑和透明

12、劑的影響，使組織變硬發(fā)脆5材料太硬或太粗補 救 辦 法 ：1無法彌補2增加浸蠟時間，重新包埋3無法補救4用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進行脫水和透明5在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液 常見問題分析缺 點：石蠟帶彎曲不直原 因：1石蠟塊上下兩邊不平行2石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異4蠟塊的一邊較另一邊為軟 或兩邊的硬度不一致5材料未居蠟塊正中央6材料大而形不正補 救 辦 法 ：1取下臺木，將兩邊修干2調節(jié)標本臺，使兩者平行3移動刀片，改用新的刀口4待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋5用刀片切去部分石蠟，使材料居中6在大的一邊切去少許石蠟缺 點：切片分離、不能連成帶狀原 因：1室溫過

13、低2石蠟過硬3材料邊緣留蠟太少4刀的角度不適合補 救 辦 法 ：1在切片機上方開一電燈或提高室溫2在蠟塊面加一層45的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面3重新包埋4矯正刀的角度缺 點：切片卷起呈圓筒狀原 因：1室溫過低2石蠟過硬3刀口太鈍4刀的傾角太大補 救 辦 法 ：1提高室溫2加軟蠟3 用毛筆將蠟片攤開壓住，切23 片即成帶4減小傾角缺 點：切片粘附于切片刀，皺摺在一起原 因：1室溫過高2石蠟過軟3刀口上留有一層石蠟4刀口鈍補 救 辦 法 ：1降低室溫2將蠟塊投入涼水中稍浸3切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟4磨刀或移動刀口缺 點：石蠟塊將蠟帶抬起原 因：1由于摩擦而產(chǎn)生靜電荷所致2石蠟塊

14、上面附有石蠟碎屑3刀口上附有石蠟碎屑補 救 辦 法 ：1提高室溫2用刀片將碎屑清除3用二甲苯或氧仿清除（2）冰凍切片的制作取材冰凍切片機切片冰凍膠固定展片(一）優(yōu)點： 1簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。 2快速，用時短。 3組織變化不大。 4能很好保存脂肪，類脂等成分。 5能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。（二）缺點： 1不容易做連續(xù)切片。 2切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結或者組織凍結不均，影響切片及染色效果。 3不容易制作較薄的切片。 4組織塊在凍結

15、過程中容易產(chǎn)生水的結晶而影響細胞的形態(tài)結構及抗原物質的定位，并且組織結構也不如石蠟切片清晰。石蠟切片和冰凍切片的比較名稱石蠟切片冰凍切片操作步驟繁瑣簡單抗原活性可能會破壞組織的抗原性完好地保存各種抗原活性及酶類切片厚薄薄厚優(yōu)點薄，觀察結構清晰；連續(xù)切片抗原活性好，適合免疫組化；簡便操作缺點做免疫組化時部分需抗原修復不能連續(xù)切片；不能較薄切片細胞通透脫蠟、復水封閉抗原修復封片、鏡檢二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗DAB顯色（3）免疫酶法脫蠟和復水：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色?？乖迯停河捎诮M織中部分抗原在甲醛

16、或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。 常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。一般用微波修復中火6min*4次，效果不錯。注意微波修復后自然冷卻30min左右（只要你覺得修復液的溫度達室溫即可）。細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗

17、原結合。血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續(xù)結果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發(fā)生結合；可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫30min。但也要防止封閉過度。一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r間：一抗孵育條件在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復溫45min。具體條件還要摸索二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時

18、間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。建議一抗反應在4度最佳，反應溫和，但時間最好不超過1624h。切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。溫柔浸洗，防止切片的脫落。沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。PBS的pH和離子強度的使用和要求。建議pH在7.4-7.6濃度為0.01M。（中性及弱

19、堿性條件（pH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗；DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色背景，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明

20、你的抗體濃度過低或孵育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。產(chǎn)生組織切片非特異性染色1、抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。3、血清封閉時間不夠，這需要通過延長動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；4、DAB孵育時間過長或濃度過高；5、PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗/二抗孵育后的浸洗尤為重要；6、標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。 常見問題分析染色后切片著色呈陰性結果1、抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤。2

21、、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合；3、血清封閉時間過長。4、DAB孵育時間過短。5、細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。6、組織切片本身這種抗原含量低；7、開始做免疫組化，建議一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。（4）免疫熒光固定、復水封閉二抗孵育一抗孵育封片、鏡檢浸洗浸洗細胞通透固定、復水封閉封片、鏡檢二抗孵育一抗孵育浸洗浸洗組織切片固定：切好片風干后立即用冰丙酮/甲醇等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片保持避光和濕

22、度。應在暗室中進行檢查；標本受紫外線照射35min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過23h；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油。NIKON熒光顯微鏡操作規(guī)程使用須知操作流程注意事項 使用須知1.在記錄本上登記“日期” 、“使用人”、“實驗內容”，檢查使用記錄中的上次汞燈關閉時間，確保汞燈關閉后至少40min才能再次開啟使用。2.進入顯微鏡室后首先記錄顯微鏡汞燈指數(shù)，檢查汞燈指數(shù)和上次汞燈使用記錄是否一致，若不一致請聯(lián)系儀器負責人。記錄汞燈實際開啟時間后方可進行實驗操作，使用結束后記

23、錄汞燈實際關閉時間并再次記錄汞燈指數(shù)，完成使用記錄后歸還鑰匙和記錄本。汞燈開啟時間不得超過2h。3.使用過程中，顯微鏡后部的照明燈箱可產(chǎn)生高溫，請勿在亮燈或熄燈40min內觸摸燈箱，也不要在燈箱周圍放置纖維織品、紙張或易燃物質如酒精、二甲苯等。 取下的防塵罩收入抽屜內，一定不要搭在燈箱上。 操作流程NIKON倒置熒光顯微鏡1.取下防塵罩，確認熒光控制閥旋在關閉位置（C），打開汞燈電源（使汞燈預熱），綠色指示燈亮。2.打開顯微鏡電源，綠色指示燈亮。依次計算機電源，CCD電源。打開鹵燈開關（白色按鈕），旋轉亮度調控手輪調亮視野。將標本置于載物臺中間，旋轉選擇4物鏡，調節(jié)焦距至清晰度最佳。依次旋轉1

24、0倍、20倍、40 倍物鏡來選擇所需的高倍物鏡，每次調焦幅度要輕，以免損傷鏡頭（換用高倍物鏡后只允許使用細調焦手輪）。125634操作流程4.將鹵光強度調到最小后關閉鹵燈開關，熒光控制閥旋到開啟位置（O）。 確保汞燈電源開啟35min 后按下汞燈激發(fā)按鈕，手動旋轉激發(fā)方式轉換盤選擇相應濾片（G、B、UV）。5.使用完畢，將熒光光閘旋到關閉位置（C），依次關閉汞燈電源、CCD電源、鹵燈電源、顯微鏡電源和計算機電源，順時針轉動粗調焦手輪使物鏡緩慢降至最低位，旋轉物鏡轉換器使無鏡頭筒沖上。6.關閉電源40min待燈箱變涼后，蓋上防塵罩。125634 注意事項1.在調節(jié)焦距時一定要在4 物鏡下進行調節(jié)

25、，然后再換成高倍鏡使用細調焦手輪進行小幅調動，直接在高倍鏡下直接調焦可能會造成物鏡鏡頭接觸到標本，損傷到鏡頭。2.在低倍物鏡換用高倍物鏡時，不要用手指直接轉動物鏡，應手握轉換器上層的轉動板來轉換物鏡，否則可能會使物鏡的光軸發(fā)生偏斜。且由于轉換器材料質地軟、精度高，螺紋受力不均勻便容易松脫，螺紋損壞可能導致整個轉換器的報廢。注意事項4. 以上操作規(guī)程未涉及到的旋鈕、濾片等其他部件，切勿隨意按動。5. 請不要隨意改動拍攝軟件的基本設置（曝光時間除外），若要改動，請告知儀器負責人；顯微鏡使用完畢后將顯微鏡載物臺和桌面上的雜物清理干凈，待汞燈變涼后蓋上防塵罩。使用熒光顯微鏡注意事項：1、嚴格按照熒光顯

26、微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；2、檢查時間每次以12h為宜，最少開機30min才可關機。超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；3、熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應從開始就記錄使用時間。4、燈熄滅后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數(shù)次點燃光源。關閉汞燈至少在30分鐘后開啟。5、使用完畢后請將干燥劑放回載物臺，待整個裝置冷卻后蓋好防塵罩。使用后嚴格登記制度，對使用時間、使用狀態(tài)、使用人都要有詳細的記錄。（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked ImmunoSorbent

27、Assay, ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗 酶與底物反應產(chǎn)生不透明沉積物或有色產(chǎn)物，顏色深淺代表反應的強弱。此顏色深淺可用酶標儀精確地測定出來。1、ELISA的原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。雙抗體夾心法是檢測抗原最常用

28、的方法，操作步驟如下：1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗原的量。間接法是檢測抗體常用的方法。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結

29、合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗體的量。（以間接性ELISA為例）：顯色2、ELISA試劑的組成完整的ELISA試劑盒應包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑，俗稱酶標板）；（2）酶標記的抗原或抗體（酶標記物）；（3）酶的底物；（4）系列參考標準品（定量測定）；（5）酶標記物及

30、樣本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）反應終止液。 3、ELISA試劑的作用固相載體：固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應。可作ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。 酶標記物：即酶標記的抗原或抗體，是ELISA中最關鍵的試劑。良好的酶標記物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。酶標記物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在酶標記物中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或

31、游離的抗體（或抗原）。此外酶標記物還要有良好的穩(wěn)定性。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)。HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。ETM

32、B經(jīng)HRP作用后產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCl或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。洗滌液洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一

33、般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。酶反應終止液常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。參考標準品定量測定的ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。 4、ELISA實驗過程加待測樣品固相包被加酶標物比色判定結果加終止液加底物溫育溫育洗滌溫育洗滌加樣在ELISA實驗中一般有5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。加樣時應將所加物加在E

34、LISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣時一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換槍頭，以免發(fā)生交叉污染。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。封閉封閉是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。 最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高

35、濃度使用（5%）。封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結果。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。洗滌ELISA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工

36、操作主要為浸泡式，過程如下： a.吸/甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即吸去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸/甩干孔內液體。吸/甩干應徹底，也可吸/甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。顯色和比色顯色反應的溫度和時間是影響顯色的因素。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。底物顯色一般在室溫或37反應20-30分鐘后即不再加深，約40分鐘將達到顯色的頂峰，再延長反應時間，會使本底值增高。底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。產(chǎn)物用各類酸性終止液終止后會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。比色比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如TMB的吸收