免疫實(shí)驗(yàn)人外周血單核細(xì)胞分離課件

1、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課外周血單個(gè)核細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)內(nèi)容外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離（實(shí)驗(yàn)）淋巴細(xì)胞分離及檢測(cè)技術(shù)（講解）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諉蝹€(gè)核細(xì)胞分離及淋轉(zhuǎn)的原理和方法熟悉淋巴細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞分離純化的目的 測(cè)定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動(dòng)物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌捎貌煌椒?，主要需考慮(1)細(xì)胞純度；(2)細(xì)胞獲得量；(3)細(xì)胞活力；Ficoll密度梯度離心法常用來分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分層液：比重是 1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分層液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大(1.092)，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單

2、核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重(1.070)，離心后漂浮于分層液的液面上，吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個(gè)核細(xì)胞。 比重：1.070比重：1.077 比重：1.092 FicollFicoll密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)材料分組：兩人一組器材數(shù)量試劑數(shù)量滴管2支/2人分層液1ml/2人EP管1個(gè)/2人血液1ml/2人計(jì)數(shù)板1塊/2人PBS1瓶/4人1ml刻度吸管1支/4人計(jì)數(shù)液1管/4人加樣器(tip)1把/4人顯微鏡1臺(tái)/4人實(shí)驗(yàn)步驟1. 加樣：吸取1ml稀釋的血液沿試管壁緩慢加至分層液頂部； NOTE：不要打破血液與分層液的界面；2. 分離：2,000r/min離心15min，離心后

3、管內(nèi)液體可分為四層，見后圖；3. 回收：將吸管直接插入灰白層，沿管壁輕輕吸出灰白層單個(gè)核細(xì)胞，放入EP管中，400ml左右即可； NOTE：盡量少吸分層液； 4. 計(jì)數(shù)：將EP管中的細(xì)胞液上下顛倒混勻，取出20ml加入新的EP管中，再加入20ml細(xì)胞計(jì)數(shù)液，混勻后取出10ml，加到計(jì)數(shù)板內(nèi)，顯微鏡下計(jì)數(shù)。示意圖細(xì)胞計(jì)數(shù)方法查出四個(gè)大方格的總細(xì)胞數(shù)(X)算出每個(gè)大方格的平均細(xì)胞數(shù)：Y=X/4每個(gè)大方格的體積為V=1mm1mm0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（/ml)=Y104稀釋倍數(shù)4顯微鏡下活細(xì)胞形態(tài)淋巴細(xì)胞分離及檢測(cè)技術(shù)巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞DC細(xì)胞紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離

4、及檢測(cè)技術(shù)淋巴細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞的功能測(cè)定技術(shù)淋巴細(xì)胞分離一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法二、淋巴細(xì)胞亞群的分離及鑒定 1. E花環(huán)分離法 2. 尼龍纖維分離法 3. 流式細(xì)胞術(shù) 4. 磁珠分離術(shù)E花環(huán)分離法（純化T細(xì)胞）T細(xì)胞表面的CD2分子綿羊紅細(xì)胞受體（E受體）尼龍纖維分離法 B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附特性，將淋巴細(xì)胞懸液加到尼龍纖維上，37作用12小時(shí)后，洗脫的為非粘附性T細(xì)胞。T細(xì)胞尼龍纖維毛柱PBMCB細(xì)胞單核細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） FCM將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，是當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。流式細(xì)胞儀工作原理免疫磁珠分離術(shù)1. 直接法： 抗細(xì)胞表面分子抗體+磁性微球 免疫磁珠+細(xì)胞懸液 強(qiáng)磁場 與免