結(jié)核病的病原學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷

1、結(jié)核病的病原學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷主要內(nèi)容結(jié)核病的流行情況1結(jié)核病的病原學(xué)32結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷3結(jié)核病的分子藥敏341.結(jié)核病的流行概況全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化人口大規(guī)模流動(dòng)結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴(yán)重 結(jié)核病合并艾滋病感染我國(guó)是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國(guó)結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動(dòng)性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年2011 WHO tuberculosis control report我國(guó)是全球27個(gè)耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一2013年世界衛(wèi)生組織宣布全球耐多藥結(jié)核病緊急狀態(tài)全球的結(jié)核病患者,在接受治療之前已經(jīng)傳染給了別人！早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵：有細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)的病人不

2、超過50%當(dāng)前結(jié)核研究的熱點(diǎn)新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(shù)(40%)新型結(jié)核疫苗(10%)7/45近期結(jié)核病診斷方法的相關(guān)研究JID 2012:205 (Suppl 2), S147.2.結(jié)核病的病原學(xué) 結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)是引起人類結(jié)核病的主要病原體。1882年由德國(guó)醫(yī)生Koch發(fā)現(xiàn)。結(jié)核分枝桿菌屬于厚壁門、裂殖菌綱、放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬。分枝桿菌復(fù)合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型結(jié)核分枝桿菌是人類主要的致病菌。2022/8/10GDTB8結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學(xué)主要特點(diǎn)：1. 細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的

3、疾病都呈慢性，并伴肉芽腫生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)緩慢，繁殖一代在人工培養(yǎng)基內(nèi)約需要1520小時(shí)，在靜脈感染未經(jīng)免疫小鼠肺中約需要15小時(shí)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)約需要1520小時(shí)，在家兔角膜中約需要2022小時(shí)。實(shí)驗(yàn)室檢查方法的歷史1880sTubercle bacilli的發(fā)現(xiàn) Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test (TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培養(yǎng)基1940sDubos agar, Ogawa 培養(yǎng)基1950sM

4、iddlebrook 7H91990sNAAT2000sELISPOT, QuantiFERON,2010sLPA, GeneXpert2020s ?3.結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷 細(xì)菌學(xué)涂片：敏感性低傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：所需時(shí)間長(zhǎng)，23月 分子生物學(xué)TB-DNATB-mRNA 血清/免疫學(xué)IGRA：有望替代TST，但不能區(qū)分活動(dòng)性TB與潛伏感染血清學(xué)：存在抗原純度和特異性差等方面的問題液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：平均時(shí)間20天.細(xì)菌學(xué)診斷萋尼氏染色熒光染色羅氏培養(yǎng)/藥敏試驗(yàn)我國(guó)目前最常用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)快培/藥敏試驗(yàn)涂片 干燥 固定初染脫色復(fù)染 顯微鏡檢查登記/報(bào)告顯微鏡檢查堿性復(fù)紅鹽酸酒精亞甲蘭石炭酸金胺

5、O鹽酸酒精高錳酸鉀光學(xué)顯微鏡檢查熒光顯微鏡檢查萋尼氏染色鏡下形態(tài)熒光染色鏡下形態(tài)LED Fluorescence microscopyLED熒光顯微鏡LED 熒光顯微鏡成本低廉的超亮發(fā)光二極管可承受的價(jià)格，價(jià)格接近于現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡壽命長(zhǎng)（ 15-20,000小時(shí)）省電可用電池供能可靠性更強(qiáng)不需要空調(diào)設(shè)施不需要暗室診斷性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡操作人員工作負(fù)荷減輕普通熒光顯微鏡和發(fā)光二極管熒光顯微鏡性能比較（不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行匯總與平均）顯微鏡方法靈敏度 (%)特異度 (%)普通熒光顯微鏡直接涂片67.496.1普通熒光顯微鏡濃集涂片66.699.2發(fā)光二極管 熒光顯微鏡直接涂片71.6 (p=

6、0.1025)96.4發(fā)光二極管 熒光顯微鏡濃集涂片72.4 (p=0.0073)98.8BactecMGIT 960/320Bact/Alert 3DVERSA TREK生產(chǎn)廠家美國(guó)BD公司法國(guó)生物梅里埃公司美國(guó)Trek 診斷公司 儀器定位專業(yè)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)普通細(xì)菌血培養(yǎng)系統(tǒng)需加裝分枝桿菌培養(yǎng)特殊組件普通細(xì)菌血培養(yǎng)系統(tǒng)需加裝分枝桿菌培養(yǎng)特殊組件單機(jī)容量960個(gè)檢測(cè)位每年可至少檢測(cè)8000個(gè)樣本240個(gè)瓶位每年可檢測(cè)2000個(gè)樣本528個(gè)瓶位日均標(biāo)本處理量2530個(gè)67個(gè)9個(gè)檢測(cè)原理熒光增強(qiáng)法：采用敏感性較強(qiáng)的熒光信號(hào)探測(cè)氧氣的變化情況，只需單一反應(yīng)，所以速度快，準(zhǔn)確性高PH值比色

7、法：當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)有微生物生長(zhǎng)，其釋放出的CO2，經(jīng)水飽和后，產(chǎn)生H+，使PH值產(chǎn)生變化，感應(yīng)器的顏色也隨之變化。需雙重反應(yīng)，因此速度較慢，假陽性率較高，此技術(shù)已趨向淘汰壓力檢測(cè)：檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)中各種氣體產(chǎn)生和消耗而引起的瓶?jī)?nèi)壓力的變化。靈敏度差。此技術(shù)已趨向淘汰檢測(cè)技術(shù)瓶外檢測(cè)技術(shù)瓶外檢測(cè)技術(shù)瓶?jī)?nèi)檢測(cè)技術(shù)易導(dǎo)致污染及生物安全問題平均陽性報(bào)告時(shí)間 811天1521天不詳藥敏試劑5種一線抗TB藥物，全部具有FDA及SFDA認(rèn)證無藥敏試劑提供只有3種一線藥物培養(yǎng)/藥敏試驗(yàn)陰性培養(yǎng)陽性培養(yǎng)無或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FF

8、FFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強(qiáng)熒光傳感器對(duì)氧氣高度敏感的釕復(fù)合物肉湯改良Middlebrook 7H9肉湯上部空間已預(yù)先充填10% CO2BACTEC MGIT 960/320 指示器系統(tǒng)MGIT /3D制造的液體培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)比固體培養(yǎng)快 (平均 10-12 天 vs. 20-24 天)比固體培養(yǎng)基更敏感可以自動(dòng)判讀，或使用標(biāo)準(zhǔn)指示管和操作手冊(cè)進(jìn)行判讀也加快了藥敏試驗(yàn)的速度局限需要NALC-NaOH進(jìn)行痰處理和離心普通菌群的污染很常見比固體培養(yǎng)更經(jīng)常地檢出非結(jié)核分枝桿菌（常常不致?。┐_定診斷前必須對(duì)所有的陽性培養(yǎng)物進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的鑒定比固體培養(yǎng)基昂貴血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷技

9、術(shù)優(yōu)勢(shì)：是一種對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷的理想方法。無需活細(xì)胞培養(yǎng)和特殊儀器設(shè)備操作簡(jiǎn)便結(jié)果顯示快速目前用于血清學(xué)診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELlSA)斑點(diǎn)金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(Western Blotting)等等WHO對(duì)來自不同國(guó)家的19種試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測(cè)的靈敏度為1%60%，特異度為5399% 1 。原因：由于所用的測(cè)定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果差異較大，并且缺乏可比性。WHO認(rèn)為現(xiàn)有的血清學(xué)診斷試劑的敏感度和特異度都有待進(jìn)一步提高，不推薦其作為一種快速診斷的方法在臨床使用。1WHO World Hea

10、lth Organization. Diagnosis evaluation series No.2: laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.WHO對(duì)結(jié)核抗體評(píng)估2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學(xué)試劑在結(jié)核檢測(cè)中存在較大差異，且檢測(cè)結(jié)果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學(xué)方法作為結(jié)核桿菌的診斷實(shí)驗(yàn)1 。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of T

11、uberculosis. 不能早期診斷！容易漏診、誤診！血清學(xué)檢測(cè)的評(píng)價(jià)結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、法國(guó)、荷蘭、日本等二十余個(gè)國(guó)家寫入本國(guó)的結(jié)核診療指南中。目前應(yīng)用的進(jìn)口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In

12、 Tube（QFT-GIT）2）英國(guó)蛋白水平分子診斷:-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA)-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRA） 干擾素檢測(cè)陰性干擾素檢測(cè)陽性TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞 干擾素T-SPOT.TB原理T-SPOT.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結(jié)核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，

13、CFP 10）結(jié)核桿菌特異抗原由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)ESAT-6與CFP-10抗原結(jié)核桿菌特異抗原蘇氏?？八_斯戈登牛非洲T-SPOT.TB臨床性能指標(biāo) 特異性只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng) 美國(guó)FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306) 國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率 美國(guó)FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183) 國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(62

14、4/655)靈 敏 度ReferenceSensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0% (12/12) Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3% (20/24) Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6% (84/87) Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3% (21/23) Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9% (70/7

15、3) Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65*92.2% (59/64) Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3% (57/58) Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0% (27/30) Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9% (26/28) Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9% (26/28) Soysal et al IJTLD 200

16、8 12(1):50-56*80.8% (80/99) Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7% (36/42) Chee et al J Clin Microbiol. 2008 Apr 9*94.1% (254/270) Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8*84.6% (11/13) Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-887.2% (34/39) Losi et al Eur Respir

17、J. 2007 Dec;30(6):1173-9100.0% (10/10) Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259100.0% (22/22) Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624*100.0% (9/9) Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34*87.5% (42/48) Kobashi et al. J Infect. 2008 Epub ahead of print.*90.0% (36/40) Domnguez et al. Di

18、agn Microbiol Infect Dis. 2008.* Epub ahead of print84.2% (32/38) Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.*89.9% (62/69) Bosshard et al. Respir Med. 2008. Epub ahead of print98.4% (62/63) Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. Epub ahead of print*95.9% (47/49) TOTAL92.0% (1139/1238) 特 異 性T-SPOT.TB

19、的實(shí)驗(yàn)步驟用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血單個(gè)核細(xì)胞結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞使其分泌-干擾素效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌的-干擾素與膜板預(yù)包被的抗-干擾素抗體結(jié)合并固定在細(xì)胞周圍1個(gè)斑點(diǎn)=1個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞加入顯色液，觀察結(jié)果過夜孵育，洗板，加入酶標(biāo)二抗陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對(duì)照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對(duì)照（PHA）實(shí)驗(yàn)效果圖方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測(cè)靈敏度的提高有利于臨床對(duì)結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴(kuò)散快速48小時(shí)出結(jié)果方法學(xué)的局限不

20、能區(qū)分活動(dòng)性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床的判斷目前還不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來判斷患者是活動(dòng)性結(jié)核病或是潛伏感染者檢測(cè)收費(fèi)高（800元/次）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋 陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：感染階段不同；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾??；實(shí)驗(yàn)非正常操作。 陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動(dòng)性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測(cè)指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果： 4種環(huán)境分枝桿菌感染時(shí)：（堪薩斯）、（蘇氏）、（海）、（戈登）各國(guó)對(duì)潛伏感染風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查指南風(fēng)險(xiǎn)人群美國(guó)指南加拿大指南英國(guó)指南免疫力抑制人群

21、（例如，HIV感染者，使用強(qiáng)的松或TNF-抑制劑治療）TST或IGRA；如果是陰性或高度懷疑的，TST和IGRA都要檢查TST，如果TST陰性要用IGRA確認(rèn)TST或IGRABCG接種者（如果也屬于其它風(fēng)險(xiǎn)人群）推薦用IGRA沒有特定的推薦TST或IGRA與傳染性肺結(jié)核患者密切接觸TST或IGRATST，用IGRA進(jìn)一步確認(rèn)TST陽性TST，用IGRA進(jìn)一步確認(rèn)TST陽性醫(yī)務(wù)工作者TST或IGRA推薦用TSTTST或IGRA，視情況而定無法再來確認(rèn)TST結(jié)果的人群（例如，流浪漢，注射吸毒者或交通不方便）推薦用IGRA沒有特定的推薦推薦用IGRA國(guó)外出生的人群只篩查過去5年內(nèi)移民的人群；TST或

22、者IGRA只篩查過去2年內(nèi)小于15歲的移民；TST，用IGRA進(jìn)一步確認(rèn)TST陽性只篩查新移民；TST篩查5至15歲移民，用IGRA進(jìn)一步確認(rèn)TST陽性；IGRA篩查16至35歲移民其它風(fēng)險(xiǎn)人群TST或IGRATST，用IGRA進(jìn)一步確認(rèn)TST陽性TST，用IGRA進(jìn)一步確認(rèn)TST陽性樣本量為26 680 調(diào)查者的15個(gè)多中心研究顯示,在4年的隨訪中,IGRA-陽性的個(gè)體中發(fā)病數(shù)為448 例/1000人/每年. 2011年9月的研究結(jié)果提示，IGRA-陰性對(duì)于兒童（小于5歲）不能排除結(jié)核病(Pediatr. Infect. Dis. J.30, 817818, 2011). Childhood

23、 tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.TB-DNA檢測(cè)：1. 能穩(wěn)定檢測(cè)10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強(qiáng)。2. 早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結(jié)核 血液播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病 腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結(jié)核病3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。4. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢(shì)

24、，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對(duì)藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù) 。分子生物學(xué)診斷Real-time PCR 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)的技術(shù)特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63-65)下保溫3060分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)2小時(shí)全過程目測(cè)法檢測(cè)流程檢測(cè)方法說明結(jié)果判斷 在陰性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色呈橙色，陽性對(duì)照反應(yīng)管液體顏色呈綠色的條件下： 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色呈綠色，則可報(bào)告該樣本檢

25、測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性； 若待檢樣本反應(yīng)管中液體顏色呈橙色，則可報(bào)告該樣本檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陰性； 若陰陽性對(duì)照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測(cè)結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測(cè)。RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)：RNA 拷貝數(shù) DNA拷貝數(shù)更具臨床意義: 生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍RNA遠(yuǎn)不如DNA穩(wěn)定病原體死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.較好的愈后指標(biāo)結(jié)核桿菌RNA(TB-RNA)SAT技術(shù)原理操作過程4. 結(jié)核病的分子藥敏HAIN 技術(shù)DNASTRIPT-spot -Xpert MTB/ RIFDNA微陣芯片探針熔解曲線技術(shù)藥物藥物作用機(jī)制參與基因編 碼 酶作 用突變頻率（%

26、）INH氧自由基對(duì)DNA，脂質(zhì)等多效應(yīng)Kat G觸酶-過氧化物酶活化原藥4258INH對(duì)NADH競(jìng)爭(zhēng)性INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成代償katG功能inhAkasAahpCndhnat glf烯?；d體蛋白還原酶酮?；鞍缀铣擅竿榛鶜溥^氧化物酶NADH脫氫酶芳香胺乙酰轉(zhuǎn)移酶吡喃半乳糖變位酶分支菌酸代謝靶酶靶酶？ 靶酶？NAD+ 減少乙?；Щ領(lǐng)NH靶酶？21341015耐藥標(biāo)記物RFP抑制信使RNA轉(zhuǎn)錄rpoBRNA多聚酶靶酶96100PZA酸化胞漿，失活酶活性抑制脂肪酸代謝？替代煙酰胺摻入NAD抑制膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能pncAFasI吡嗪酰胺酶Fas I？活化原藥靶酶？7297EMB阿拉伯半乳

27、聚糖合成抑制阿拉伯呋喃糖累積脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制embCABembB阿糖轉(zhuǎn)移酶靶酶4765SM肽鏈翻譯錯(cuò)誤rpsLrrs核糖體30S亞基S12蛋白核糖體16SrRNA靶位靶位5259821AK/KMOFx肽鏈翻譯錯(cuò)誤抑制DNA回旋酶rrsgyrA核糖體16SrRNADNA回旋酶A亞基靶位靶酶7594Cs抑制肽聚糖合成ulrA/dadBD-丙氨酸合成酶靶酶原理：采用線性探針技術(shù)（LiPA），擴(kuò)增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。檢測(cè)標(biāo)本：涂陽痰標(biāo)本/TB-DNA陽性標(biāo)本固體或液體培養(yǎng)菌株 Hain 技術(shù)GT-Blot 48自動(dòng)雜交儀1臺(tái) 所需設(shè)備：GTQ PCR

28、96擴(kuò)增儀1臺(tái) Mikro 220 離心機(jī)1臺(tái) 恒溫器1臺(tái)超聲波振蕩儀1臺(tái) TARGET靶基因菌種鑒定16SrRNA IS6110異煙肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh 利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺 pncA鏈霉素 rpsL、rrs喹諾酮類藥物 gyrA、gyrB MTBDRplus 方法原理：PCR擴(kuò)增檢測(cè)rpoB、katG和inhA基因突變位點(diǎn)，診斷RFP和INH耐藥。rpoB 野生型探針: WT1 - WT8rpoB 耐藥突變探針: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L 通過缺失的野生型信號(hào)進(jìn)行突變探測(cè) 通過出現(xiàn)的突變信號(hào)

29、進(jìn)行突變探測(cè)MTBDRplus rpoB511513516518522526531533rpoB WT2rpoB WT4rpoB WT6rpoB WT8rpoB WT7rpoB MUT1 (D516V)rpoB MUT3 (S531L)rpoB MUT2A (H526Y)rpoB MUT2B (H526D)514515rpoB WT1rpoB WT3rpoB WT5509508505MTBDRplus 操作流程DNA提取用NALC/NaOH處理痰標(biāo)本2) PCR擴(kuò)增3) 雜交擴(kuò)增產(chǎn)物和固化在膜上的特異性探針雜交4) 結(jié)果判讀MTBDRplus 反應(yīng)條帶(示范)Bandelette MTBDR

30、(Hain Lifescience) 鑒定結(jié)核菌利福平rpoBINHkatG 315藥物GenoType MTBDRplus結(jié)果比例法藥敏結(jié)果 耐藥 敏感 INH 耐藥 45 0 敏感 7 16靈敏度：86.5% (45/52)特異度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/68)菌株標(biāo)本 GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較藥物GenoType MTBDRplus結(jié)果比例法藥敏結(jié)果 耐藥 敏感 RFP耐藥 48 0 敏感 1 16靈敏度：98.0% (48/49)特異度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65)菌株標(biāo)本 GenoType MT

31、BDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較痰標(biāo)本（涂片陽性）GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較藥物GenoType MTB DRplus結(jié)果比例法藥敏結(jié)果 耐藥 敏感 INH 耐藥 63 0 敏感 1 129靈敏度：98.4% (63/64)特異度：100%(129/129)符合率：99.5%(192/193)痰標(biāo)本（涂片陽性）GenoType MTBDRplus方法與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較藥物GenoType MTBDR plus結(jié)果比例法藥敏結(jié)果 耐藥 敏感 RFP 耐藥 39 12 敏感 2 140靈敏度：95.1% (39/41)特異度：92.1% (14

32、0/152)符合率：92.7% (179/193)優(yōu)點(diǎn)：Hain 技術(shù)可以快速檢測(cè)RFP和INH的耐藥時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、安全高 特異性和靈敏度較高、重復(fù)性好主觀因素影響小、更為可靠缺點(diǎn):需要專門設(shè)備；未發(fā)現(xiàn)所有的耐藥突變位點(diǎn)，不能檢測(cè)所有藥物的耐藥基因型；MTBDR plus試劑盒的檢測(cè)試紙條，缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍，否則可進(jìn)一步提高INH耐藥檢測(cè)的敏感性；不能取代傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、只能作為參考。進(jìn)行標(biāo)本處理、實(shí)時(shí)PCR和利福平耐藥性檢測(cè)的完整平臺(tái)此平臺(tái)由FIND和Cepheid（一個(gè)加州公司）所開發(fā)痰標(biāo)本可以直接放入模塊中，而無需與任何試劑進(jìn)行混合處理GeneXpert 設(shè)備可進(jìn)行標(biāo)本液化、去污染、富集、DNA提取、 r