胞核胞漿胞膜制備試劑盒

1、 技術咨詢電話：400-607-9999注意：本制品僅供研究使用，請勿用于臨床治療等其他用途捌胞核胞漿胞膜制翱備試劑盒把 版Nucl-Cy埃to-Mem 按Prepara傲tion Ki稗t安貨號：柏P060004瓣描述：班從哺乳動物新鮮矮或凍存的組織塊稗、貼壁或懸浮培唉養(yǎng)細胞中，制備胺細胞核、細胞膜礙與胞內質膜、細叭胞漿等三種主要擺亞細胞組分。獨隘特的試劑成分與瓣優(yōu)化的制備方案挨相結合，使胞核捌-案胞膜般-阿胞漿制備過程簡瓣單易行，無需特岸殊設備和超速離伴心，制備過程可奧在藹1案小時內完成。制岸備的細胞核、細奧胞漿組分純度甚疤高，而且較少交疤叉污染。單一的把細胞膜的純化是罷一個特殊問題，奧本

2、試劑盒制備的班胞膜是細胞膜和靶細胞器如線粒體胺、內質網、高爾藹基體及其質膜的芭混合物。制備的皚細胞核是完整的懊未裂解的細胞核岸，但胞漿組分為啊可溶性胞漿蛋白襖。制備的亞細胞皚組分的純度可勝澳任后續(xù)免疫共沉襖淀、安SDS-PAG巴E哀、板2-D gel疤電泳、扳Western瓣 Blotti昂ng巴、酶活性測定、岸受體分析等。胺組成罷：骯(啊5安0 extra岸ctions,扮 8 x 10敗6罷 cells 半per ext拔raction傲)班CER, Cy靶tosol E暗xtracti唉on Reag矮ent隘，埃25胺ml; 瓣絆MER, Me頒mbrane 柏Extract敖ion

3、Rea捌gent胺，稗2.5捌 ml昂NER, Nu叭clear E瓣xtract唉ion Rea奧gent敖，唉50背 ml;捌Suspens唉ion Buf巴fer藹，愛1把0 ml 矮儲存氨：班4 C扮避光保存暗1擺年。拌收集細胞稗：絆準確計數，每一爸制備使用等量的按細胞數，將明顯跋改善后續(xù)檢測結叭果的一致性。每奧一制備約需要矮8 x 10鞍6版 1 x 柏10半7癌個細胞。扒貼壁細胞熬：翱PBS凹沖洗細胞皿，胰岸蛋白酶消化細胞俺。岸800 x g傲 哀離心笆5-10 mi氨n敖。棄上清，用擺PBS岸重懸洗滌細胞并笆再次離心收集細皚胞。注意：為避盎免胰蛋白酶在后吧續(xù)制備過程中降擺解蛋白質

4、，可用埃無酶細胞消化液矮(拌Non-enz吧yme Cel氨l Disas愛soci跋at巴ion Sol搬ution翱)八使貼壁培養(yǎng)的細笆胞與瓶皿分離。拌懸浮細胞：絆800 x g耙 俺離心哀5-10 mi板n鞍。棄上清。用半PBS愛重懸洗滌細胞并斑再次離心收集細礙胞。骯估計細胞沉淀壓襖積皚PCV (pa埃cked ce澳ll volu俺me)艾：拔通常巴1 x 10俺6邦 傲個細胞離心后的艾PCV扳約為扳10骯-昂20 八l邦，澳1 x 10背7白 傲個細胞的按PCV傲約為百100扒 礙l拌。注意襖PCV愛大小與細胞數量佰有關，也與細胞班類型、大小、離懊心速度有關。制備步驟 癌制備全程在爸

5、4 C胺或冰水浴中進行皚。敖1.1 扳細胞勻漿裂解襖每耙1 x 10哀7頒個細胞或哎昂100叭 瓣l壩 半PCV叭的細胞沉淀加入懊500骯 愛l拌 CER熬試劑，震蕩重懸阿。冰浴艾2 min熬。將細胞懸液轉岸移到冰預冷的玻暗璃勻漿器內。冰阿上上下手動勻漿盎20-30般次。瓣注意：破碎細胞敗是關鍵環(huán)節(jié)。用翱1-3 ml胺小容積玻璃勻漿哀器，須選用間隙艾嚴密的研杵，其骯特征是將研杵插拌入勻漿器套管后疤，可提起研杵而扮套管不會脫落。佰有效研磨是上下半推拉研磨而不是扒旋轉。破碎效果熬與細胞類型有關伴?？稍谙嗖铒@微哀鏡下檢查，未裂霸解細胞應少于扮5%鞍。扮1.2 盎組織塊勻漿裂解斑取艾250 mg叭哺乳

6、動物新鮮或熬-80 C傲凍存的組織塊，癌勿剪碎為更小的拔塊。放入拔冰預冷的玻璃勻挨漿器內。癌加入敖5稗00百 翱l壩 CER愛試劑。用埃研杵旋轉將組織背塊搗碎，愛上下手動預勻漿伴20扮次。冰浴搬10 min俺。然后上下手動暗預勻漿稗7藹次。芭注意：與培養(yǎng)細伴胞特別是貼壁細叭胞相比，組織塊暗中的細胞在勻漿襖時較易破碎，因岸而并非必須選用哀間隙嚴密的研杵矮。如果研杵與套拜管過于嚴密，組敖織勻漿困難，可按選用研杵與套管熬稍松的勻漿器。伴破碎效果與組織把細胞類型有關。柏可在相差顯微鏡拜下檢查，未裂解唉細胞應少于柏5%哎。跋2. 傲取出捌啊500百 疤l盎裂解混合物，轉俺移到皚1.5 ml氨離心管。扳8

7、埃00 g哀，敗4 C傲離心百5 min斑。粗細胞核沉淀拜在管底，上清為扳胞膜跋-絆胞漿混合物。按叭照以下步驟首先胺制備膜與胞漿，把然后制備細胞核癌，或用兩臺離心案機同時制備。辦3. 絆膜與胞漿制備：挨3.1. 芭將步驟伴2 般獲得的上清液轉隘移到新管，估計案上清液體積；礙3.2. 斑立即加入癌1/10斑積量的拔MER傲與上清液混合。澳冰浴爸5頒分鐘；隘3.3. 澳最大轉速哎14,000 哎rpm 4 阿C半離心八30跋分鐘；拌3.4. 拔取出上清液轉移岸到新管，此為胞愛漿組分；熬3.5. 凹沉淀為胞膜組分俺，含細胞膜和細柏胞內質膜的混合辦物。再次瞬時離斑心除盡液體，用半100拔 笆l壩或背適

8、宜體積的拌Suspens版ion Buf矮fer癌或自備溶液重懸拔胞膜。笆4. 班細胞核制備：啊4.1. 頒加入扮500伴 拔l NER芭，振蕩重懸半步驟奧2 巴獲得的粗核。必拜要時按步驟安1.1懊勻漿胞核；昂4.2. 40拔00 g胺，矮4 C版離心霸5 min爸。棄上清；扳4.3. 骯再次加入背500佰 霸l NER拔洗滌暗胞核沉淀，并重捌復步驟斑4.2罷，離心后的上清八應清亮；哀4.4. 盎棄上清除盡液體傲。用鞍100爸 阿l艾或凹適宜體積扳Suspens壩ion Buf熬fer唉或自備溶液重懸百細胞核。說明背制備的胞漿組分拌或重懸于埃Suspens霸ion Buf靶fe隘的胞膜胞核組分

9、稗可進行癌Bradfor啊d瓣法、版Lowry佰法、伴BCA靶法蛋白定量、酶襖活性測定、受體啊分析。但進行免拔疫共沉淀、擺SDS-PAG百E昂、藹2-D gel矮電泳、扮Western暗 Blot邦之前，需要笆1:1扳加入自備的挨2x 耙樣品緩沖液稗(隘含適宜濃度的去皚垢劑如暗NP-40捌、鞍Triton 稗X-100邦、叭SDS)敗。用戶可不用壩Kit板中的岸Suspens哎ion Buf稗fer半，而直接用自行拔配制的樣品緩沖哀液重懸胞核或胞艾漿沉淀，但這是暗要考慮自配緩沖拔液中是否有影響爸蛋白定量的因素佰。阿用瓣SDS-PAG八E Loadi艾ng 瓣緩沖液裂解細胞扮核后，爸DNA跋釋放會使核裂解疤物十分粘稠，可昂95 C氨加熱辦5 min拌，高速振蕩打斷巴DNA邦，重復加熱唉2-3半次。熬如果為凝膠阻滯胺實驗隘(EMSA)挨目的提取核蛋白爸，建議用愛#P1200:擺 按核隘-矮胞漿蛋白制