植物源性食品中單氰胺殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

1、 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中單氰胺殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物源性食品中單氰胺殘留量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于植物源性食品中單氰胺殘留量的測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 2763 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法原理試樣中的單氰胺用水和丙酮等溶劑提取，再經(jīng)固相材料分散凈化處理，凈化液與丹磺酰氯（dansyl chloride）反應(yīng)后生成的衍生

2、物經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)，外標(biāo)法定量。 試劑和材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水。試劑乙腈（CH3CN，CAS號(hào)：75-05-8）：色譜純。丙酮（CH3COCH3，CAS 號(hào)：67-64-1）：色譜純。碳酸鈉（Na2CO3，CAS號(hào)：497-19-8）。碳酸氫鈉（NaHCO，CAS號(hào)：144-55-8）。丹磺酰氯（C12H12ClNO2S，CAS號(hào)：420-04-2）：純度98.0%，-18-20保存。溶液配制碳酸鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取0.53 g碳酸鈉，用水溶解并定容至25 mL。碳酸氫鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取1.6

3、8 g碳酸氫鈉，用丙酮溶解并定容至100 mL。碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液（0.2 mol/L，4+46）：吸取4 mL碳酸鈉溶液（Na2CO3，0.2 mol/L），加入46 mL碳酸氫鈉溶液（NaHCO，0.2 mol/L），混合均勻。丹磺酰氯溶液（5.0 g/L）：稱取0.5 g丹磺酰氯，用丙酮溶解并定容至100 mL。水（0.1 %甲酸）：稱取100 L甲酸，用水溶解并定容至100 mL。標(biāo)準(zhǔn)品單氰胺（CN2H2，CAS號(hào)：420-04-2）標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.0%。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制單氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 mg/L）：準(zhǔn)確稱取單氰胺標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于50 mL燒杯中，用丙酮溶解后轉(zhuǎn)移到 1

4、00 mL容量瓶中，并用丙酮定容。放置于04冰箱，有效期1個(gè)月。單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 mg/L）：吸取5.0 mL單氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于50 mL容量瓶中，用丙酮定容。放置于04冰箱，有效期23周。材料多壁碳納米管（MWCNTs）：粒徑范圍，10 nm20 nm；顆粒物長(zhǎng)度：5 m15 m；比表面積（22525）m2/g。濾膜：0.22 m，有機(jī)系。儀器和設(shè)備5.1 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（ESI）。5.2 分析天平：感量 0.000 1 g、感量 0.0 1 g。5.3 組織搗碎儀。5.4 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10 000 r/min。5.5 渦旋振蕩器。5.6 恒溫水浴鍋。試

5、樣的制備蔬菜、水果和食用菌樣品按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)取一定量，取樣部位按GB 2763規(guī)定執(zhí)行。對(duì)于個(gè)體較小的樣品，取樣后全部處理；對(duì)于個(gè)體較大的基本均勻樣品，可在對(duì)稱軸或?qū)ΨQ面上分割或切成小塊后處理；對(duì)于細(xì)長(zhǎng)、扁平或組分含量在各部分有差異的樣品，可在不同部位切取小片或截成小段或處理；取后的樣品將其切碎，充分混勻，用四分法取樣或直接放入組織搗碎機(jī)中搗碎成勻漿。勻漿放入聚乙烯容器中。取谷類樣品500 g，粉碎后使其全部可通過(guò)425 m的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，放入聚乙烯瓶或袋中。取油料作物、茶葉、堅(jiān)果和香辛料樣品各500 g，粉碎后充分混勻，放入聚乙烯瓶或袋中。植物油類攪拌均勻。 試樣于-18 條件下保存。分析步驟提取蔬

6、菜、水果類稱取10 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，參見附表A.1補(bǔ)水，然后視基質(zhì)不同加入10-30 mL丙酮（4.1.2），不同基質(zhì)有機(jī)提取溶劑用量參考附表A.1，渦旋振蕩5 min，超聲10 min后，以 4 000 r/min 離心5 min，待凈化。谷物、堅(jiān)果、油料作物、植物油類稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，參見附表A.1補(bǔ)水，然后視基質(zhì)不同加入10-20 mL丙酮（4.1.2），不同基質(zhì)有機(jī)提取溶劑用量參考附表A.1，渦旋振蕩5 min，超聲10 min后，以 4 000 r/min 離心5 min，待凈化。香辛料、茶葉類稱取2 g（精確

7、至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，參見附表A.1補(bǔ)水，然后加入8 mL乙腈（4.1.1），渦旋振蕩5 min，超聲10 min后，以 4 000 r/min 離心5 min，待凈化。食用菌類稱取10 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，參見附表A.1補(bǔ)水，然后加入8 mL乙腈（4.1.1），渦旋振蕩5 min，超聲10 min后，以 4000 r/min 離心5 min，待凈化。凈化7.2.1蔬菜、水果、堅(jiān)果、谷物類吸取1 mL提取液于稱有5 mg多壁碳納米管（4.5.1）的 1.5 mL離心管中，渦旋1 min后，以10 000 r/min 離心1 min，取上清液過(guò)0

8、.22 m 有機(jī)系濾膜（4.5.2或4.5.3）于2 mL離心管中，并用空白基質(zhì)配制好基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，待衍生化。注：特殊干擾嚴(yán)重基質(zhì)例如韭菜，需采用10 mg多壁碳納米管（4.5.1）。植物油、油料作物類吸取1 mL提取液直接過(guò)0.22 m有機(jī)系濾膜（4.5.2）于2 mL離心管中，并用空白基質(zhì)配制好基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，待衍生化。香辛料、茶葉類準(zhǔn)確吸取2 mL提取液直接于5 mL離心管中，加入2 mL正己烷，渦旋振蕩3 min，棄去正己烷層，重復(fù)凈化一次，取乙腈層1 mL于稱有10 mg多壁碳納米管（4.5.1）的1.5 mL離心管中，渦旋1 min，以10 000 r/min離心1 min，取上清液過(guò)0

9、.22 m有機(jī)系濾膜（4.5.2）于2 mL離心管中，并用空白基質(zhì)配制好基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，待衍生化。食用菌類準(zhǔn)確吸取2 mL提取液直接于5 mL離心管中，加入2 mL正己烷，渦旋振蕩3 min，棄去正己烷層，取乙腈層1 mL于稱有10 mg多壁碳納米管（4.5.1）的1.5 mL離心管中，渦旋1 min，以10 000 r/min離心1 min，取上清液過(guò)0.22 m有機(jī)系濾膜（4.5.2）于2 mL離心管中，并用空白基質(zhì)配制好基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，待衍生化。衍生化取0.5 mL凈化后的提取液于2 mL離心管中，加入0.5 mL 碳酸鈉/碳酸氫鈉混合溶液（4.2.3），混勻后再加入0.5 mL丹磺酰氯丙酮溶液

10、（4.2.4），渦旋1min，于50水浴中衍生1 h，衍生后以10 000 r/min離心1 min，取上清液過(guò)0.22 m有機(jī)系濾膜（4.5.2），供檢測(cè)。除樣品外，單氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液也應(yīng)按此方法同時(shí)進(jìn)行衍生化。儀器參考條件7.4.1 液相色譜參考條件a) 色譜柱：C18，100 mm 2.1 mm，粒徑1.9 m；b) 流動(dòng)相：乙腈-水（0.1%甲酸）=50+50，等度洗脫；c) 流速：0.2 mL/min；d) 柱溫：室溫； e)進(jìn)樣體積：10 L；f) 運(yùn)行時(shí)間：4 min。注：如液相色譜不是超高效液相色譜，也可配置普通規(guī)格C18色譜柱，150mm3.0mm，粒徑5m，或相當(dāng)者，運(yùn)行時(shí)間根

11、據(jù)出峰情況進(jìn)行調(diào)整。質(zhì)譜參考條件a) 離子源：電噴霧離子源；b) 掃描方式：負(fù)離子掃描； c) 噴霧電壓：3000 V； d) 毛細(xì)管溫度：350 ； e) 氣化溫度：300 ； f) 鞘氣：N2，30 psi；g) 輔助氣：N2，10 arb；h) 碰撞氣：氬氣，1.5 mTorr；i) 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見表2。表2 單氰胺衍生物的保留時(shí)間和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件中文名稱保留時(shí)間min定量離子對(duì)定性離子對(duì)碰撞能量V單氰胺衍生物1.8274/258274/23030；33標(biāo)準(zhǔn)工作曲線將單氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白提取液稀釋成質(zhì)量濃度為0.0015 mg/L、0.015

12、 mg/L、0.03 mg/L、0.15 mg/L、0.3 mg/L或0.6 mg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)衍生化（7.3）后按參考色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定。以單氰胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其衍生物的峰面積（扣除空白基質(zhì)中的本底）為縱坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。注：如空白基質(zhì)中出現(xiàn)干擾峰，在繪制線性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)需將本底扣除。定性及定量7.6.1保留時(shí)間被測(cè)試樣中單氰胺衍生物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，相對(duì)誤差應(yīng)在2.5%之內(nèi)。定量離子、定性離子及子離子豐度比在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，如果檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品

13、相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，目標(biāo)化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，而且同一檢測(cè)批次，對(duì)同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在單氰胺。表2 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度50%20%至50%10%至20%10%允許相對(duì)偏差20%25%30%50%測(cè)定將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)溶液經(jīng)衍生化后分別注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，以保留時(shí)間和定性離子定性，樣品中單氰胺質(zhì)量濃度應(yīng)在基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線最高點(diǎn)的則應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析，采用外標(biāo)

14、法定量?？瞻自囼?yàn)除不加試樣外，采用完全相同的步驟進(jìn)行平行操作。結(jié)果計(jì)算試樣中單氰胺的殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）計(jì)算： QUOTE =AsVAsm QUOTE =AsVAsm . (1)式中：A 試樣溶液中單氰胺衍生物的峰面積；As 標(biāo)準(zhǔn)溶液中單氰胺衍生物的峰面積；s 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中單氰胺的質(zhì)量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V 提取液的總體積（提取有機(jī)溶劑體積加補(bǔ)水的體積再加上基質(zhì)含水的體積），單位為毫升（mL）；m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）3 衍生化稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)結(jié)果大

15、于1 mg/kg時(shí)保留三位有效數(shù)字。精密度9.1 在重復(fù)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差不大于重復(fù)性限（r），重復(fù)性限（r）的數(shù)據(jù)為：含量為0.01 mg/kg時(shí)，重復(fù)性限（r）為0.004；含量為0.05 mg/kg時(shí)，重復(fù)性限（r）為0.014；含量為0.1 mg/kg時(shí)，重復(fù)性限（r）為0.019；含量為0.5 mg/kg時(shí)，重復(fù)性限（r）為0.094。9.2 在再現(xiàn)性條件下，兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差不大于再現(xiàn)性限（R），再現(xiàn)性限（R）的數(shù)據(jù)為：含量為0.01 mg/kg時(shí)，再現(xiàn)性限（R）為0.006；含量為0.05 mg/kg時(shí)，再現(xiàn)性限（R）為0.032；含量為0.1 mg/kg時(shí)

16、，再現(xiàn)性限（R）為0.036；含量為0.5 mg/kg時(shí)，再現(xiàn)性限（R）為0.27。其他食用菌、香辛料和茶葉方法的定量限為0.05 mg/kg，其它樣品方法的定量限為0.01 mg/kg。圖譜圖1 單氰胺衍生物全掃質(zhì)譜圖圖2 0.000 5 mg/L單氰胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖圖3 0.00 5 mg/L單氰胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖附 錄 A（資料性附錄） 所選基質(zhì)含水量、稱樣量及提取前補(bǔ)水量信息表表A.1所選基質(zhì)含水量、稱樣量、提取前補(bǔ)水量及有機(jī)提取溶劑用量信息表基質(zhì)名稱含水量%稱樣量g提取前補(bǔ)水量g有機(jī)提取溶劑有機(jī)提取溶劑用量mL結(jié)球甘藍(lán)85101.5丙酮30芹菜95100.5丙酮20番茄951010.5丙酮20茄子90101.0丙酮30馬鈴薯80102.0丙酮30