RNA轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程、特征和應(yīng)用

1、RNA 轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程 、特征和應(yīng)用本章 內(nèi)容RNA 轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程 轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始原核與真核生物mRNA的特征比較終止和抗終止內(nèi)含子的剪接、編輯、再編碼及化學(xué)修飾基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個(gè)階段。轉(zhuǎn)錄是指拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同（除了TU之外）的RNA單鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的核心步驟。翻譯是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。DNA分子中的核苷酸排列順序不但決定了胞內(nèi)所有RNA及蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，還通過(guò)蛋白質(zhì)（酶）的功能間接控制了細(xì)胞內(nèi)全部有

2、效成份的生產(chǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。與mRNA序列相同的那條DNA鏈?zhǔn)蔷幋a鏈（coding strand）或稱有意義連（sense strand），另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈則被稱為模板鏈（template strand）或稱反義鏈（antisense strand）。DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關(guān)系。DNA和RNA雖然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它們的生物學(xué)活性卻很不同。RNA主要以單鏈形式存在于生物體內(nèi)，其高級(jí)結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，它們既擔(dān)負(fù)著貯藏及轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。因?yàn)橹挥衜RNA所攜帶的遺傳信息才被

3、用來(lái)指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成，所以人們一般用U、C、A、G這4種核苷酸而不是T、C、A、G的組合來(lái)表示遺傳性狀。生物體內(nèi)擁有三類RNA 編碼特定蛋白質(zhì)序列的mRNA；能特異性解讀mRNA 中的遺傳信息并將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸后加入多肽鏈中的 transfer RNA （tRNA）；直接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成的ribosomal RNA （rRNA）。3. 1 RNA的轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程：無(wú)論是原核還是真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程都包括：模板識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始通過(guò)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的終止。模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開(kāi)形成轉(zhuǎn)錄泡以促

4、使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。I 模板識(shí)別大腸桿菌中依賴于DNA的RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程圖示。轉(zhuǎn)錄泡中單鏈DNA的長(zhǎng)度約在17bp左右，被聚合酶復(fù)合物所保護(hù)的DNA序列約為35bp左右。真核生物RNA聚合酶不能直接識(shí)別基因的啟動(dòng)子區(qū)，需要一些被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的輔助蛋白質(zhì)按特定順序結(jié)合于啟動(dòng)子上，RNA聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物（preinitiation transcription complex, PIC），以保證有效地起始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)啟動(dòng)子階段，此時(shí)RNA聚合酶一直處于啟動(dòng)子區(qū)，新生的RNA鏈

5、與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來(lái)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開(kāi)始。II 轉(zhuǎn)錄的起始 (initiation)一旦RNA聚合酶成功地合成9個(gè)以上核苷酸并離開(kāi)啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入正常的延伸階段。所以，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間代表一個(gè)啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。RNA聚合酶離釋放因子，核心酶沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個(gè)核苷酸。隨著RNA聚合酶的移動(dòng)，DNA雙螺旋持續(xù)解開(kāi)，暴露出新的單鏈DNA模板，新生RNA鏈的3末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。III 轉(zhuǎn)錄的延

6、伸（elongation）當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí) ，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二脂鍵。RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài) RNA聚合酶和RNA鏈都被從模板上釋放出來(lái) IV 轉(zhuǎn)錄的終止 （termination）37時(shí)，轉(zhuǎn)錄生成mRNA的速度大約是每分鐘2500個(gè)核苷酸，即每秒鐘合成14個(gè)密碼子，而蛋白質(zhì)合成的速度大約是每秒鐘15個(gè)氨基酸。正常情況下，從一個(gè)基因開(kāi)始表達(dá)到細(xì)胞中出現(xiàn)其mRNA的間隔約為分鐘，而再過(guò)半分鐘就能在細(xì)胞內(nèi)測(cè)到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。3. 2 轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分1. RNA聚合酶RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中最關(guān)鍵的酶，主要以雙鏈DNA為模板，以4種核苷三

7、磷酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2+為輔助因子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產(chǎn)物是與DNA模板鏈相互補(bǔ)的RNA。Capable of polymerization but not initiation（1）RNA polymerase core enzymeCore enzyme + sigma factorThe sigma factor is a separate protein required for initiationThere are many different sigma factorsDifferent sigma factors all

8、ow for the expression of different genes（2）RNA polymerase holoenzymea2bbsa2bb + sholoenzyme core polymerase sigma factor（3）各個(gè)亞基的功能 Phosphodiester bond formationDNA bindingDNA bindingAssemble holoenzyme因子能識(shí)別并與啟動(dòng)子區(qū)的特異性序列相結(jié)合The five subunits of the bacterial enzyme are distinguished by color. Only the

9、N-terminal domains of the alpha subunits are included in this model. 核心酶 （Core Enzyme） 作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過(guò)程（終止） 依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性 基團(tuán)與DNA的磷酸根之 間） 非專一性的結(jié)合（與DNA的序列無(wú)關(guān)） 結(jié)合常數(shù)：1011mol全酶（Holo Enzyme） 用于轉(zhuǎn)錄的起始 依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合 (與核心酶結(jié)合后 引起的構(gòu)象變化) 專一性地與DNA序列(啟動(dòng)子)結(jié)合 結(jié)合常數(shù)：1014mol 半衰期：數(shù)小時(shí) 轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（ 的結(jié)合 ） 此外，新發(fā)現(xiàn)的一種亞基的功能尚不

10、清楚。2、各亞基的特點(diǎn)和功能 （1） 因子（sigma factor） 因子可重復(fù)使用 修飾RNApol構(gòu)型 使Holo Enzyme 識(shí)別啟動(dòng)子的35區(qū),并通過(guò)與模 板鏈結(jié)合2 2 2 2（3）全酶的組裝過(guò)程因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，它是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識(shí)別模板上的啟動(dòng)子。核心酶在T7噬菌體DNA上約有1300個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，平均結(jié)合常數(shù)為21011。因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，酶底結(jié)合常數(shù)提高103倍，酶底復(fù)合物的半衰期可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)十小時(shí)。因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)降低104倍，使酶底復(fù)合物的半衰期小

11、于1秒。大腸桿菌中的因子能識(shí)別并與啟動(dòng)子區(qū)的特異性序列相結(jié)合因子基因功能-35區(qū)間隔（bp）-10區(qū)70rpoD廣泛TTGACA16-18TATAAT32rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTA54rpoN氮代謝CTGGNA6TTGCA 不同的因子識(shí)別不同的啟動(dòng)子 E.coli 中有四種因子（70、32、54、28） 枯草桿菌中有6種因子 （因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）（2）因子 核心酶的組建因子 促使RNA聚合酶與DNA模板鏈結(jié)合酶 2 2 前端因子使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈 尾端因子使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈 （3） 因子 完成核苷酸底物之間的磷酸酯鍵的連

12、接 Editing 功能（排斥與模板鏈不互補(bǔ)的堿基） 與Rho （）因子競(jìng)爭(zhēng)RNA 3end促進(jìn)RNA聚合酶NTP RNA elongation （4） 因子 參與RNA非模板鏈（sense strand）的結(jié)合 （充當(dāng)SSB） 由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個(gè)功能位點(diǎn) 有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（ 亞基提供） DNA/RNA雜交鏈結(jié)合位點(diǎn)（亞基提供） 雙鏈DNA解鏈位點(diǎn)（前端 亞基提供） 單鏈DNA重旋位點(diǎn)（后端亞基提供） 因子作用位點(diǎn)Core Enzyme 具有的四個(gè)功能位點(diǎn) DNA/RNA 雜交位點(diǎn)() D. S.DNA 解鏈位點(diǎn)() D. S.DNA 重旋() 啟動(dòng)子識(shí)別位點(diǎn) DNA有義

13、鏈結(jié)合位點(diǎn)( ) No proofreading nuclease activities1 error in 105 bpAbout 105 lower than replicationThe fidelity（保真性） of RNA polymerase 真核生物中的RNA 聚合酶 真核生物中有3類RNA聚合酶，其結(jié)構(gòu)比大腸桿菌RNA聚合酶復(fù)雜，它們?cè)诩?xì)胞核中的位置不同，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的基因不同，對(duì)-鵝膏覃堿的敏感性也不同。真核生物RNA聚合酶一般有8-14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)5105真核生物RNA聚合酶的主要特征聚合酶中有兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)1105的大亞基；同種生物3類聚合酶有“共享

14、”小亞基的傾向，即有幾個(gè)小亞基是其中3類或2類聚合酶所共有的。真核細(xì)胞中三類RNA聚合酶特性比較Ten of the twelve subunits constituting yeast RNA polymerase II are shown in this model. Subunits that are similar in conformation to those in the bacterial enzyme are shown in the same colors. The C-terminal domain of the large subunit RPB1 was not ob

15、served in the crystal structure, but it is known to extend from the position marked with a red arrow.All three yeast polymerases havefive core subunits homologous , the two and subunits of E. coli RNA polymerase. The largest subunit (RPB1) of RNA polymerase II also contains an essential C-terminal d

16、omain (CTD). RNA polymerases I and III contain the same two nonidentical-like subunits, whereas RNA polymerase II contains two other nonidentical-like subunits. All three polymerases share the same -like subunit and four other common subunits. In addition, each yeast polymerase contains three to sev

17、en unique smaller subunits.2. 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動(dòng)子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物(closed complex)，此時(shí)，DNA仍處于雙鏈狀態(tài)。然后，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開(kāi)放復(fù)合物 (open complex)，聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開(kāi)。對(duì)于強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，從封閉復(fù)合物到開(kāi)放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。開(kāi)放復(fù)合物與最初的兩個(gè)NTP相結(jié)合并在這兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后即轉(zhuǎn)變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元復(fù)合物。除RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中至少還需要7種輔助因子參與

18、。一般情況下，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑合成并釋放2-9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；盡快釋放亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過(guò)上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DNA和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物較為穩(wěn)定，可長(zhǎng)時(shí)間與DNA模板結(jié)合而不解離。只有在遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)，RNA聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導(dǎo)致聚合酶本身從模板DNA上脫落。3.3 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄的起始啟動(dòng)子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合形成起始轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的區(qū)域 ，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)。3.3.1 原核生物的啟動(dòng)子I

19、. 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)在多數(shù)情況下為嘌呤（90%），常見(jiàn)的序列為CAT， A為轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)。II. -10序列 （Pribonow Box）-10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合位點(diǎn)（B 位點(diǎn)）一致序列：(T80A95T45A60A50T96 ）因此又稱TATA Box位置范圍 -18 bp 到-9 bp保守TTATA區(qū)：酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)（富含AT堿基，利于雙鏈打開(kāi)） III. -35序列 （Sextama Box）-35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶依靠其亞基識(shí)別該位點(diǎn)大多數(shù)啟動(dòng)子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45重要性:很大程度上決定了啟動(dòng)子的

20、強(qiáng)度位置在不同啟動(dòng)子中略有變動(dòng)TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識(shí)別的信號(hào) IV. -10區(qū)和-35區(qū)間距離在90%的原核生物中為 16到18bp適宜的距離能為 RNA聚合酶提供合適的空間結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄的起始。典型的原核生物的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)為 -35， 1619bp的間隔區(qū)， -10區(qū)和 轉(zhuǎn)錄 起始點(diǎn)， -10區(qū)到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離 為 7bp。大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識(shí)別的啟動(dòng)子區(qū)RNA polymerase scans DNA linearlySlides along DNA without opening strandsDetects sequences of -10 and -35 i

21、n the major grooveSigma factor allows RNA polymerase to bind to promoter 原核生物轉(zhuǎn)錄的起始 A. 全酶與啟動(dòng)子結(jié)合的封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成 （ R位點(diǎn)被因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合 ） 開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物的形成 RNApol的一個(gè)適合位點(diǎn)到達(dá)10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富 含AT的Pribnow 框的“熔解”， 形成1217bp的泡狀物，同時(shí)酶分子向10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物使RNA聚合酶定向兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和DNA ） c. 在開(kāi)放型的啟動(dòng)子復(fù)合物中，RNApol的I位點(diǎn)和E位點(diǎn)的 核苷酸前體間形成第一個(gè)磷酸

22、二酯鍵（ 亞基） 三元復(fù)合物形成 +1位多為CAT模式,位于離開(kāi)保守T 69 個(gè)核苷酸處 -6-9 bp- GC T ATTGACATATAAT-16-19 bp-+1-35 sequence-10 sequence（4） 因子解離 核心酶與DNA的親和力下降 起始過(guò)程結(jié)束核心酶移動(dòng)進(jìn)入延伸過(guò)程轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程核心酶1217bp（亞基）啟動(dòng)子各位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系（1）35 序列與10 序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子 35 TTGACA 10 TATAAT不同的啟動(dòng)子的區(qū)別： a. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子序列同源性越高 啟動(dòng)強(qiáng)度越大 b. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子同源性越低 啟動(dòng)強(qiáng)度越小 c. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子差異很大

23、時(shí) 由另一種因子啟動(dòng) 原因-35序列通過(guò)被 因子識(shí)別的容易程度決定啟動(dòng)子強(qiáng)度-10序列影響開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物形成的速度 決定啟動(dòng)子強(qiáng)度 （2） 35序列與10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 堿基序列并不重要 間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高 間距上的突變種類： 間距趨向于17bp 上升突變 間距遠(yuǎn)離17bp 下降突變 1、 RNA聚合酶的啟動(dòng)子 結(jié)構(gòu)最復(fù)雜 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游,有多個(gè)短序列元件組成 通用型啟動(dòng)子（無(wú)組織特異性）（1）TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框）位于-25 -30處 一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50

24、（T37)定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能 ,類似原核生物的-10序列的Pribnow框TATA框是絕大多數(shù)真核基因的正確表達(dá)所必需的 3.3.3 真核生物的啟動(dòng)子（2） CAAT框（CAAT box） 位于-70-80區(qū)處 一致序列為GGC/TCAATCT 前兩個(gè) G 的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率) 增強(qiáng)啟動(dòng)子的效率、頻率，不影響啟動(dòng)子的特異性（3） GC框（GC box） 在-80-110區(qū)，含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（4） 帽子位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，堿基大多為A 以上三個(gè)保守序列在絕大多數(shù)啟動(dòng)子中都存在RNA聚合酶的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) （5）增強(qiáng)子（enhancer）：能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子。又稱遠(yuǎn)上游序列（far upstream sequence）它是遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)啟動(dòng)子以增加轉(zhuǎn)錄速率的DNA序列，其增強(qiáng)作用與序列的方向無(wú)關(guān)，與它在基因的上下游位置無(wú)關(guān)。增強(qiáng)子有強(qiáng)烈的細(xì)胞類型選擇，即不同細(xì)胞類型，增強(qiáng)作用不同。Binding of Acti