吉林大學(xué)HE染色

1、HE染色1切片的一般程序封固石蠟切片取材固定(24-48h)脫水(70,80%4h;90,95%2h,100%1h(2)透明(二甲苯10min(2)浸蠟(30min(3)包埋切片染色2顯微標(biāo)本制作技術(shù)從保存時間長短分，有臨時玻片標(biāo)本和永久玻片標(biāo)本。從制作的方法來分，有涂片、壓片、裝片(也叫整裝法)、磨片和切片等 。切片法徒手切片法石蠟切片法火棉膠切片法冰凍切片法3材料和夾持物切取的標(biāo)本1.徒手切片法 4滴水放置標(biāo)本加蓋蓋玻片葉的橫切5取 材 1. 材 料 新 鮮 最 好 是 動 物 的 心 臟 還 在 跳 動 時 取 材 ， 立 即 投 入固 定 液 內(nèi) 。 應(yīng) 爭 取 在 死 后 半 小 時

2、 內(nèi) 處理 完 畢 2. 組 織 塊 力 求 小 而 薄 ,以 不超 過 5毫 米 為 在 可 能 范 圍 內(nèi) 也 應(yīng) 力 求 短 小 。 以 使 固 定液 能 迅 速 而 均 勻 地 滲 入 組 織 塊 內(nèi) 部 3. 勿 使 組 織 塊 受 擠 壓 。 取 材 時 ， 組 織 塊 可 稍 取 大 一 點 。4. 要 熟 悉 取 材 的 部 位 要 能 準(zhǔn) 確 地 按 解 剖 部 位 取 材 ， 如 胰腺 ， 一 般 取 胰 島 較 多 的 胰 腺 尾 部 ， 脊 髓 取 腰 膨 大 與 頸 形 大 5. 選 好 組 織 塊 的 切 面 縱 切 或 橫 切 往 往 是 顯 示 組 織 結(jié) 構(gòu)

3、明 晰 的 關(guān)鍵 。6. 保 持 材 料 的 清 潔 組 織 塊 上 如 有 血 液 、 污 物 、 粘 液 、 食物 、 糞 便 等 ， 可 用 生 理 鹽 水 沖 洗 ， 然 后 再 入 固 定 液 ， 但 要 注 意 防止 組 織 損 傷 。6空腔性器官注意橫斷面和縱斷面 保護內(nèi)皮和粘膜橫斷：氣管、食管、血管縱斷：胃底、腸、心臟心瓣膜左心室左心房7特殊的組織或者器官血液、骨髓：涂片肌肉、神經(jīng)：骨、牙齒：脫鈣 切片 酸8固 定 的 方 法1. 蒸 氣 固 定 法 比 較 細(xì) 小 而 薄 的 標(biāo) 本 ， 可 用 餓 酸 或 甲 醛 蒸 氣固 定 。 主 要 用 于 血 液 或 細(xì) 胞 涂 片

4、 以 及 某 些 薄 膜 組 織 等 的 固 。 如血液 涂 片 ， 則 應(yīng) 在 血 片 未 干 燥 前 就 與 餓 酸 蒸 氣 接 觸2注 射 、 灌 注 固 定 法. 某 些 組 織 塊 由 于 體 積 過 大 或 固 定 掖極 難 滲 入 內(nèi) 部 或 需 要 對 整 個 臟 器 或 整 個 動 物 進 行 固 定 。如 肺 可 將 固 定 液 從 氣 管 或 支 氣 管 注 入 .全 身 灌 注 固 定 較 大 動 物如 兔 、 貓 、 狗 、 猴 及 整 個 人 體 ,固 定 液 輸 入 后 ， 可 不 必 即 刻 取 材 。小 動 物 ， 如 大 、 小 鼠 ，也可灌流固定. 3.

5、小 塊 組 織 固 定 法. 從 人 體 或 動 物 取 下 的 小 塊 組 織 ， 須 立即 置 入 液 態(tài) 固 定 劑 中 進 行 固 定 ， 這 是 應(yīng) 用 最 廣 泛 最 經(jīng) 常 的 方 法 。9固 定 的 目 的1. 迅 速 阻 止 組 織 、 細(xì) 胞 的 死 后 變 化 ， 防 止 自 溶 與 腐 敗 ， 使 之盡 量 保 持 生 前 的 狀 態(tài) 與 結(jié) 構(gòu) 。2. 使 細(xì) 胞 內(nèi) 的 蛋 白 質(zhì) 、 脂 肪 、 糖 ， 酶 等 成 分 轉(zhuǎn) 變 為 不 溶 性物 質(zhì) ， 以 保 持 其 原 有 狀 態(tài) 。 3. 使 組 織 內(nèi) 各 種 物 質(zhì) 成 分 產(chǎn) 生 不 同 的 折 光 率

6、 ， 以 便 染 色 后 易于 鑒 別 和 觀 察 4. 使 組 織 塊 在 脫 水 、 包 埋 、 切 片 、 染 色 等 過 程 中 不 易 損 壞 。5使 不 同 組 織 成 分 對 染 料 有 不 同 的 親 和 力 ， 經(jīng) 過 染 色 處 理 后易 于 辨 認(rèn) 。 6. 防 止 細(xì) 胞 過 度 收 縮 或 膨 脹 而 失 去 其 原 有 形 態(tài) 結(jié) 構(gòu) 。7. 使 組 織 塊 硬 化 ， 便 于 制 作 薄 片 。10 注 意 事 項 及 影響 固 定 的 因 素1. 組 織 塊 不 宜 過 大 ， 一 般 以 厚 度 5毫 米 ， 長 寬 不 超 過 15x15毫 米 。2. 固

7、定 液 的 量 一 般 以 組 織 塊 大 小 的 20倍 為 宜 3. 必 須 選 擇 滲 透 力 強 ， 又 不 使 組 織 過 度 收 縮 或 膨 脹 的 試 劑做固定劑.11石蠟切片標(biāo)本的固定固定液：10%中性福爾馬林固定時間：室溫3個小時，1個小時后修塊。固定方法：容器底部墊上脫脂棉或者濾紙。肺臟：液體表面覆蓋脫脂棉?？涨慌K器：漿膜面平鋪在紙板上用大頭釘固定。 膽囊放在單獨的容器內(nèi)。腦、脊髓、松軟的腫瘤、病變組織：先固定后切開。 腦最好懸吊在固定液中。睪丸、囊性組織：向腔內(nèi)注入較高濃度的固定液。骨骼標(biāo)本：剝離軟組織后鋸成小塊固定。垂體等較小組織：擦鏡紙包好滴少量伊紅標(biāo)記后固定。12沖

8、洗和保存經(jīng)過長時間福爾馬林固定和保存的組織要充分水洗，否則影響核的染色。一般置于7080%酒精中40C保存。當(dāng)酒精混濁時，更換新的酒精。13固定易出現(xiàn)的問題與主要原因扭曲變形與過度硬脆容器過小；標(biāo)本數(shù)量過多；固定時間過長。取材過于薄小，尤其疏松結(jié)締組織。表層過度，中間沒有固定透取材過厚過大；固定時間不足；固定液失效。固定液濃度高、滲透力強，表面快速硬化。局部固定不佳組織與組織重疊；組織與容器接觸；組織露出液面。注意：根據(jù)實驗?zāi)康牟煌x擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ骸?4脫水（ 一 ） 脫 水 的 意 義 與 目 的 常 用 的 固 定 劑 中 含 有 很 多 水 分 ， 在 石 蠟 或 火 棉 膠 包 埋 前

9、 。 必 須用 某 些 溶 劑 逐 步 將 組 織 塊 吸 收 的 水 分 置 換 出 來 ， 再 讓 石 蠟 或 火 棉膠 將 該 溶 荊 里 換 ， 完 成 包 埋 步 驟 。 將 組 織 塊 內(nèi) 水 份 置 換 的 過 程 就叫 脫 水 。 脫 水 時 必 須 由 低 濃 度 脫 水 劑 開 始 ， 逐 步 轉(zhuǎn) 入 高 濃 度 脫 水 劑 ，以 防 組 織 過 度 收 縮 而 變 形 ， 或 脫 水 不 完 全 而 影 響 制 片 效 果 。 脫 水 劑 必 須 具 有 下 列 特 性 ： 脫 水 劑 能 與 水 按 比 例 混 合 ， 高 濃 度 ， 一 般 指 不 含 水 份 ， 脫

10、 水 劑 也 能 與 透 明 劑混 合 。前二者特 性 能 達(dá) 到 逐 步 除 去 組 織 塊 內(nèi) 的 水 份 ， 使 組 織 塊 內(nèi) 的 水 份 全 部 被脫 水 劑 所 取 代 ， 后二者 特 性 則 為 透明步驟的 透 明 劑 完 全 取 代 組 織內(nèi) 的 脫 水 劑 創(chuàng) 造 條 件 。15 脫 水 時 間 應(yīng) 視 組 織 塊 的 大 小 及 厚 度 而 定 ， 大 致 處 理 如 下 ： 組織 塊 為 3-5毫 米 厚 者 ， 各 級 酒 精 為 3-6小 時 ， 無 水 酒 精 對 組 織有 脆 化 作 用 ， 浸 泡 時 間 還 應(yīng) 縮 短 。 實 質(zhì) 性 器 官 ， 如 腎 、

11、脾 和淋 巴 結(jié) 等 ， 在 酒 情 中 浸 泡 時 間 太 久 易 于 硬 脆 ， 脂 肪 組 織 與 疏 松 結(jié)締 組 織 在 酒 精 中 浸 飽 的 時 間 要 長 ， 特 別 是 在 95 酒 精 中 ， 以 盡 量溶 去 脂 肪 ， 并 脫 凈 殘 存 的 水 份 ， 有 利 于 包 埋 劑 滲 入 組 織 內(nèi) 。16脫水目的：利于石蠟包埋劑滲入。酒精脫水：70%和80%：可以長期保存90%、95%：2個小時。100% I、 II：各1小時。注意：某些檢查，不能經(jīng)過低濃度酒精脫水。如糖原、尿酸結(jié)晶。肝、脾、淋巴結(jié)：適當(dāng)縮短在無水乙醇內(nèi)的時間。脂肪、疏松結(jié)締組織、腦：適當(dāng)延長脫水時間。

12、17透 明二甲苯I和II：各10分鐘左右。透明時間不宜太長，否則組織收縮硬化。18透明 透明在兩種情況下進行。第一，透明是在組織脫水后浸蠟前進行，其目的不在于為了顯微鏡觀察，而是作為從脫水劑進入包埋劑的橋梁。因此，透明劑必須既能與酒精混合，又能與石蠟融合無間，二甲苯即具此性質(zhì)，故被選為常用的透明劑。 第二，透明是在片子脫水與封藏之間進行。其目的除了作為從脫水劑進入封藏劑的橋梁外，尚有使標(biāo)本透明而便于觀察的作用。 19浸 蠟透蠟 是指將材料中的透明劑逐步清除，以至完全由石蠟充分滲透。20浸 蠟石蠟熔點選擇54580C，浸蠟溫度較熔點高230C。較硬的致密組織，例如骨、軟骨、肌腱、皮膚、子宮肌選用

13、熔點較高的石蠟。疏松及脆嫩組織，例如腦、脊髓、小動物肝脾選用熔點較低的石蠟。石蠟I：1020分鐘。石蠟II：2030分鐘。石蠟III：3040分鐘。21包 埋是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟一起倒入一定形狀的容器內(nèi)，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蠟塊，以備切片。22包 埋新蠟反復(fù)熔化、冷凝，改善密度，提高韌性，質(zhì)地均勻。包埋溫度65700C.準(zhǔn)備工作 熔蠟備用；預(yù)熱包埋用具注蠟、取放組織 切面向下擺正壓平 保留適當(dāng)距離附貼標(biāo)記移置冷凝修整蠟塊粘貼標(biāo)記23包埋修塊 石蠟24 注意事項實質(zhì)性器官：最大切面向下?？涨恍云鞴伲汗鼙谇忻嫦蛳孪嗤再|(zhì)的小塊組織可以包埋在一個蠟塊中。難切的組織單獨包埋。操作要迅速，組織不能在空氣中停留太久。25石蠟切片準(zhǔn)備工作切片 通常46微米展片 550C附