細胞周期調(diào)控和檢測

1、關(guān)于細胞周期的調(diào)控與檢測第一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 生命是如何生長、生存、繁衍和死亡？在每一個生命個體中都存在一個精密的程序，或生物鐘。生物鐘決定著細胞是否、何時生長、分裂、或死亡。這就是細胞周期調(diào)控機制，它在相關(guān)基因的控制下，依據(jù)一定的規(guī)則和節(jié)奏運行著，調(diào)控細胞的生長、分裂和死亡。在胚胎細胞，細胞周期保持快速運行，在一些成年細胞中其運行慢得多，而在神經(jīng)元細胞周期幾乎完全不運行。在生長過程中的細胞，如果細胞周期不能運行，結(jié)果是死亡。而在成熟細胞，細胞周期不正確的運行，結(jié)果則是腫瘤的發(fā)生。細胞周期(cell cycle) 細胞周期調(diào)控(cell cycle regulatio

2、n) “細胞周期”也稱“細胞分裂周期”，是指一個細胞經(jīng)生長、分裂而增殖成兩個所經(jīng)歷的全過程，通?？煞譃槿舾呻A段，即G1期、S期、G2期和M期。細胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準(zhǔn)備，在S期完成其遺傳物質(zhì)染色體DNA的復(fù)制，在G2期進行必要的檢查及修復(fù)以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，然后在M期完成遺傳物質(zhì)到子細胞中的均等分配，并使細胞一分為二。 一、基本概念介紹第二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2001 Nobel PrizeLeland H. Hartwell 1970s“Checkpoint”Yeast genetics100 CDC genesStart geneTim Hunt 19

3、80sCyclinsSea UrchinsPaul M. Nurse1970sCDKsyeast 二、歷史回顧第三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月生命復(fù)制之謎的揭開 （1）1858年建立細胞理論： 生命的基本形式是細胞，機體由細胞構(gòu)成，細胞的生長復(fù)制形成了生物體的生長繁衍，細胞的異?；蛩劳鰧?dǎo)致機體的疾病或死亡。 （2）1951年發(fā)現(xiàn)了細胞分裂周期：G1 S G2 M G0 細胞生長中有兩種形式- 有絲分裂期和細胞間期細胞周期細胞間期有絲分裂期（M期）DNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）前期中期后期末期第四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）

4、隨著成熟刺激因子（maturation promoting factor, MPF），細胞周期素（cyclin），細胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的發(fā)現(xiàn)使對細胞周期及與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究有了很大進展。第五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、細胞周期各時相的動態(tài)變化、G1期（DNA合成前期，指有絲分裂完成到DNA合成之前的一段時間） RNA在此期大量合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)量明顯增加。S期所需的DNA復(fù)制相關(guān)的酶系，如DNA聚合酶，G1期向S期轉(zhuǎn)變相關(guān)的蛋白質(zhì)如觸發(fā)蛋白、鈣調(diào)蛋白、細胞周期蛋白等均在此期合成。蛋白質(zhì)的磷酸化作用在G1期開始

5、增加，這將有利于G1晚期染色體結(jié)構(gòu)成分的重排。非組蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可發(fā)生磷酸化，已知大多數(shù)蛋白激酶磷酸化發(fā)生于其絲氨酸或蘇氨酸、酪氨酸部位。 第六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月觸發(fā)蛋白是一種不穩(wěn)定蛋白，它對細胞從G1期進入S期是必須的。只有當(dāng)其含量積累到臨界值，細胞周期才能朝DNA合成方向進行。鈣調(diào)蛋白是真核細胞內(nèi)重要的鈣受體，它調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣的水平，鈣調(diào)蛋白的含量，在G1晚期可達峰值，用抗鈣調(diào)蛋白藥物處理細胞，可延緩其從G1期到S期的進程。G1期蛋白質(zhì)量的增加，可能與蛋白質(zhì)合成增強有關(guān)，而另一原因則可能使其降解的減弱。第七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月、S期

6、（DNA合成期，從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程，是細胞增殖周期的關(guān)鍵階段） S期是細胞進行大量DNA復(fù)制的階段，組蛋白及非組蛋白也在此期大量合成，最后完成染色體的復(fù)制（）DNA復(fù)制需要多種酶的參與 包括DNA聚合酶、DNA連接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸還原酶等。隨著細胞由G1期進入S期，這些酶的含量或活性可顯著增高（）DNA復(fù)制具有嚴(yán)格的時間順序 通常，GC含量較高的DNA序列在早S期復(fù)制，晚S期復(fù)制的主要為含量高的DNA序列；就染色體而言，常染色體的復(fù)制較異染色體要早，典型的例子如人類女性的細胞中，當(dāng)其它染色體都被復(fù)制完以后，才開始進行純化的X染色體復(fù)制。第八張，PPT共四十五

7、頁，創(chuàng)作于2022年6月（）S期是細胞合成的主要時相 此時細胞質(zhì)中可出現(xiàn)大量的組蛋白mRNA，新合成的組蛋白從胞質(zhì)進入胞核，與復(fù)制后的DNA迅速結(jié)合，繞成核小體，進而形成具有兩條單體的染色體。除了蛋白質(zhì)合成以外，在S期細胞中不斷進行著組蛋白的持續(xù)磷酸化。（）中心粒的復(fù)制也在S期完成 原本垂直的一對中心粒發(fā)生分離，各自在其垂直方向形成一個子中心粒，由此形成的兩對中心粒在以后的細胞周期進程中，將發(fā)揮微管組織中心的作用，紡錘體微管，星體微管的形成均與此相關(guān)。第九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月、G2期（DNA合成后期，從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始前的時期，為有絲分裂 進行物質(zhì)條件） 為細

8、胞分裂準(zhǔn)備期，細胞中合成一些與M期結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，與核膜破裂，染色體凝集相關(guān)的成熟促進因子在此期合成。微管蛋白G期合成達高峰，為M期紡錘體微管的形成提供了豐富的來源。已經(jīng)復(fù)制的中心粒在G2期逐漸長大，并開始向細胞兩極分離。、M期（有絲分裂期，細胞經(jīng)過分裂將染色體平均分配到兩個子細胞中） 在此期細胞中，染色體凝集后發(fā)生姊妹染色單體的分離，核膜核仁破裂后再重建，胞質(zhì)中有紡錘體收縮環(huán)出現(xiàn)，隨著兩個子核的形成，胞質(zhì)也一分為二，由此完成細胞分裂。第十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月G1期：為DNA合成準(zhǔn)備所需要的RNA、 蛋白質(zhì)、脂類、糖類等G1早期：細胞的生長G1晚期：為S期的DNA合

9、成做準(zhǔn)備S期（DNA合成期） DNA合成(復(fù)制) 染色體蛋白的合成：組蛋白、非組蛋白等中心粒的復(fù)制G2期（DNA合成后期）有活躍的RNA和蛋白質(zhì)合成微管蛋白，促有絲分裂因子（MPF）中心粒向兩極移動M期（有絲分裂期） DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成停止。 細胞發(fā)生一系列形態(tài)變化、結(jié)構(gòu)建成。將加倍的DNA平均分配到兩個子細胞中第十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞周期調(diào)控研究過程的重要事件-MPF的發(fā)現(xiàn)：最早發(fā)現(xiàn)，MPF是一種在G2期形成、能促進M期啟動的調(diào)控因子，稱之為促細胞成熟因子或促細胞分裂因子（MPF)。MPF由調(diào)節(jié)亞單位細胞周期素（ cyclin ）和催化亞單位細胞周期素依賴

10、性蛋白激酶（CDK）組成。1、 細胞周期調(diào)控蛋白（cell cycle- regulating protein)四、細胞周期的調(diào)控第十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2）細胞周期調(diào)控蛋白的種類A、CDK類蛋白激酶：CDK與細胞周期素結(jié)合才具有激酶的活性，故名細胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。 作用：CDK可將特定蛋白磷酸化，促進細胞周期運行。在動物中已知7種CDK，CDK1-7。B、細胞周期素（cyclin)特點：在細胞周期中呈周期性變化。作用：能與CDK結(jié)合，激活CDK，間接調(diào)節(jié)細胞周期運行。已知30余種，在脊椎動物中為cycli

11、nA1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。第十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Cyclins與CDKs結(jié)合后，CDKs才具有活性，它們兩者的結(jié)合使細胞周期有序進行。具體結(jié)合方式如下：第十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月C、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI) CKI對細胞周期起負調(diào)控作用，分為：Ink4: P16ink4a, P15ink4b, P18ink4c, P19ink4d。特異性抑制cdk4-cyclin D1, cdk6-cyclin D1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21c

12、ip1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。作用機制：未完全清楚，大多數(shù)CKI是通過直接與Thr160/161磷酸化后的CDK-cyclin復(fù)合物密切結(jié)合，直接抑制其蛋白激酶活性。現(xiàn)較為肯定的是p21，其調(diào)控水平在基因轉(zhuǎn)錄的層面，當(dāng)DNA損傷和細胞衰老時，具有轉(zhuǎn)錄因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滯細胞周期的進行。第十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月CDK activating活性位點抑制位點第十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月由于某些環(huán)境因素的作用細胞周期出現(xiàn)故障或差錯， 這些信號可是

13、細胞停留在某些點上，稱為限制點。主要檢驗點：G1/S限制點：DNA是否損傷？細胞外環(huán)境是否適宜？細胞體積是否足夠大？在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restriction point)。S期限制點：DNA復(fù)制是否完成？G2/M限制點：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？中-后期限制點：紡錘體組裝限制點。2、細胞周期限制點（check point）第十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Four checkpoints第十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3、調(diào)控細胞周期的內(nèi)、外源信號系統(tǒng)單細胞生物的增殖取決于營養(yǎng)，多細胞生物細胞的增殖與信號途徑有關(guān)。A、生長因子：

14、是與細胞增殖有關(guān)的信號物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進細胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。信號通路：ras途徑，cAMP途徑、磷脂酰肌醇途徑。B、抑素（chalone)是一種由細胞自身產(chǎn)生、分泌的，對細胞增殖起抑制作用的糖蛋白，與膜上的受體結(jié)合，引起信號轉(zhuǎn)換及在胞內(nèi)傳遞，影響細胞周期相關(guān)的蛋白的表達。具有嚴(yán)格的組織特異性和細胞周期階段特異性。作用于G1期的抑素可阻止細胞進入S期，稱S因子。作用于G2期的抑素可阻止細胞進入M期，稱M因子。第二十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月五、 細胞周期得以進行的兩大機制 細胞周期得以進行的核心機制是在一系列c

15、yclin時相起伏的調(diào)控下，相應(yīng)的CDK依次激活，驅(qū)使細胞通過G1,S,G2期，達到M期，細胞一分為二，實現(xiàn)忠于親代的細胞復(fù)制。 這一過程的順利完成取決于是否啟動（啟動機制）和能否忠于運行（監(jiān)控機制），達到忠實復(fù)制，是細胞周期調(diào)控的兩大生物學(xué)機制。第二十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1、細胞周期的啟動機制 細胞周期能否啟動進行細胞增殖，主要的調(diào)控點在G1期，它決定細胞是否通過G1期進入S期。這一調(diào)控點首先在芽殖酵母的研究中被認識，人們稱其為“起始點”（START）。一旦細胞通過start,它們勢必進入S期，完成整個細胞分裂周期。因此start有人稱之為酵母細胞周期的“決定點”。在

16、人體細胞增殖中，在G1期存在相似的調(diào)控機制。在G1期較晚時，也有一個決定點，稱為“限制點”（restriction point），與酵母的START功能類似，不同的是，人類細胞是否通過“限制點”，進入細胞周期，主要受與細胞增殖有關(guān)的細胞外生長因子的調(diào)控，而不是營養(yǎng)素。只要有相應(yīng)的生長因子存在，細胞就能通過R點進入S期，完成整個細胞周期?；氐紾0/1期。相反，如果細胞在G1期就缺乏相應(yīng)的生長因子，細胞周期的運行將停止在R點，此時細胞進入“安靜狀態(tài)，稱之為G0期。第二十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細胞周期有兩條途徑，一是cyclinD/CDK4，二是cyclinE/C

17、DK2。二者都是G1期進行的限速步驟，即cyclinD或cyclinE的過度表達，均能縮短G1期時間或加速G1期進行第二十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、細胞周期的監(jiān)控機制 DNA損傷檢測點 抑癌基因p53在人類細胞周期G1期檢測點起著關(guān)鍵性作用。還存在G2期檢測點。時相次序監(jiān)測點MPF(有絲分裂促進因子)，可以誘導(dǎo)所有細胞周期時相的細胞核發(fā)生染色體凝集。SPF(S期促進因子)，只能誘發(fā)G1期細胞進入S期而不能使G2期細胞進入M期。第二十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月六、細胞周期的界面機制1、細胞周期與DNA修復(fù) 所有的真核細胞中都高度保守者這一整套完整的精密機制

18、，承擔(dān)著DNA損傷、錯誤地發(fā)現(xiàn)，并將其信號傳遞給相應(yīng)的機制，去阻滯細胞周期的運行，并同時進行DNA損傷的修復(fù)。然后視修復(fù)情況，細胞基因的突變。決定繼續(xù)分裂或死亡，執(zhí)行一系列細胞的重要生命活動。DNA修復(fù)方式 切除修復(fù) 錯配修復(fù) : 將局部一段錯配的寡核苷酸鏈切除，重新合成之堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)全基因組切除修復(fù)轉(zhuǎn)錄切除修復(fù)第二十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、細胞周期與細胞凋亡 細胞凋亡存在有細胞周期特異性，不同因素誘導(dǎo)的細胞凋亡發(fā)生在細胞周期不同的時相 3、細胞周期與細胞分化 細胞周期不僅與細胞增殖、細胞凋亡有關(guān)，還調(diào)控著細胞分化第二十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于202

19、2年6月第二十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1、細胞周期與腫瘤的關(guān)系目前從多方面對腫瘤進行了深入研究（流行病學(xué)、病因?qū)W、遺傳），腫瘤是多因素，多步驟，多階段的。但是腫瘤的惡性增生從生物學(xué)角度看，主要表現(xiàn)在兩方面：一是腫瘤細胞的不滅性，即細胞凋亡障礙；二是細胞增殖失控，程序發(fā)生紊亂，只是增殖超常加快。這兩方面均已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展研究的熱點。通過研究發(fā)現(xiàn)了1.存在于正常細胞內(nèi)的原癌基因發(fā)生錯誤轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?.一些基因失活后正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎职┗颉＝?jīng)過70年代的癌基因時代，80年代的抑癌基因時代90年代的多基因時代或癌基因蛋白網(wǎng)絡(luò)時代，提出了一系列的理論：腫瘤多步驟里論、DNA修

20、復(fù)理論、細胞凋亡理論，進一步闡明細胞周期核心機制、細胞周期啟動機制、細胞周期檢測點機制。七、腫瘤與細胞周期第二十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、腫瘤細胞中細胞周期檢控機制的破壞細胞周期中檢測DNA損傷的檢測點至少有兩處：一處在G1-S過渡期：控制進入S期的檢測點，防止DNA受損細胞進入S期的DNA復(fù)制。另一處在G2-M過渡期：控制進入M期的檢測點，防止受損的DNA和未完成復(fù)制的DNA進入有絲分裂。這些DNA損傷檢測點的主要機制有二：一是p53依賴性機制，另一是p53非依賴性機制每一個完整的檢測點應(yīng)由四部分組成，即發(fā)現(xiàn)或傳感器（detect或sensor）、制動或拘留（stop

21、or arrest）、修復(fù)（repair）、決定（decision，divide or death）。理論上說監(jiān)測點的任何一部分出了問題，都會導(dǎo)致功能的異常，結(jié)果是遺傳不穩(wěn)定，基因受損的細胞存活和復(fù)制或細胞遺傳物質(zhì)的改變，如此細胞多步驟進化，最終成為失控性生長的腫瘤細胞。第二十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3、腫瘤細胞中細胞周期驅(qū)動機制的破壞細胞周期監(jiān)測點功能的減弱，導(dǎo)致突變基因的累積和正常細胞的進化，只有當(dāng)這些累積的突變基因破壞了細胞周期驅(qū)動機制，細胞才能進入失控性生長的境界。人們把細胞周期驅(qū)動機制比作一輛汽車或引擎，驅(qū)使其運行的因素好比“油門”；制動器運行的機制猶如“剎車”。

22、持續(xù)地踏住“油門” 或“剎車”失靈，終將失控。這正是致變因素導(dǎo)致基因突變，檢測點基因突變，突變基因累積，驅(qū)動機制失控的必然結(jié)果。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，監(jiān)控機制破壞的典型例子是P53基因的突變。大約50%的人類腫瘤都存在P53基因的突變，說明DNA損傷檢測點在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，具有重要的位置。第三十張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月From: British J. Cancer 87:129-133第三十一張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1:222-231Mutation of G1/S regulators in human cancer第三十二張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作

23、于2022年6月八、常用的細胞周期檢測方法流式細胞術(shù)PI(碘化丙錠),可以與細胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合,采用RNA抑制劑將RNA消化后,通過流式細胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA含量不同,因此,通過流式細胞術(shù)PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率:G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。值得注意的是,PI不能通過細胞膜完整的細胞(如活細胞和早期

24、凋亡細胞),在標(biāo)本制備時,必須先用乙醇或其他破膜劑增強細胞膜的通透性,才能使PI進入細胞內(nèi)與細胞內(nèi)的核酸結(jié)合。乙醇通常為終濃度為70%的冷乙醇。第三十三張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月將腫瘤細胞以1106接種于60mm培養(yǎng)板，80匯合后傳代。2472小時后用胰酶消化收集細胞，PBS洗兩遍，棄上清，加入70預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4固定12小時以上。PBS洗滌去乙醇，1000rpm, 5min，洗兩遍。0.5 ml PBS重懸細胞，加入PI和 RNaseA至終濃度50g/ml，37 溫浴30 min。用流式細胞儀測定周期。PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4保存。RNaseA：1

25、0mg/ml D、方法：第三十四張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA contentCount2N4NNormal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories第三十五張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月G1S phaseG2MG112 1DNA content The Cell CycleDNA content by flow cytometryDeconvolution into cell cycle phasesG0

26、/1G2/MSEvents第三十六張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月Measurement of sub G0/1 apoptotic particlesDNA contentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis第三十七張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4 hr, control28 hr, irradiatedG1: 94.1%S: 1.5%G2/M: 4.4%G1: 94.1%S: 1.1%G2/M: 4.8%G1: 60.6%S: 34.9%G2/M: 4.5%G1: 96.6%S: 1.6%G2/M: 1.8%10%1%90%4%28 hr, c

27、ontrol28 hr, aphidicolin 第三十八張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月O hr6 hr12 hr18 hr24 hr93.5%86.5%58.5%21.0%2%Induction of p21 results in parallel loss of NPAT foci, down-regulation of histone gene expression and inhibition of S phase entry (1)2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hr0 hrG1: 47.2%S: 34.2%G2/M: 18.7%G1: 46.3%S: 34.9%G2/M: 18.8%G1: 51.9%S: 29.8%G2/M: 18.4%G1: 56.1%S: 23.9%G2/M: 20.1%G1: 57.8%S: 17.8%G2/M: 24.5%G1: 58.5%S: 12.5%G2/M: 29.0%G1: 60.2%S: 6.8%G2/M: 33.0%G1: 60.0%S: 3.9%G2/M: 36.1%G1: 62.1%S: 2.4%G2/M: 35.5%B.A.第三十九張，PPT共四十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、BrdU摻入法 (S phase) A、原理： 在含有