補體參與的反應(yīng)

1、Part 補體參與的反應(yīng)Part T細胞數(shù)量及其功能檢測實 驗 三Email：1 補體參與的反應(yīng) 補體的溶血反應(yīng)- 免疫血清的制備與應(yīng)用 補體結(jié)合試驗 T細胞及其功能檢測 E花環(huán)形成試驗 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：形態(tài)學方法 3HTDR摻入法 MTT比色法 T細胞亞群檢測：間接免疫熒光法 免疫組化法-SABCAP法 主要內(nèi)容2 補體激活的三條途徑經(jīng)典途徑MBL途徑旁路途徑IC+C1qMBL+病原體配基細菌+C3膜攻擊復(fù)合物細胞溶解Part 補體參與的反應(yīng)3思考題材料：綿羊紅細胞、補體、免疫血清（自制）問題：請設(shè)計實驗檢驗?zāi)闼苽涞拿庖哐宓奶禺愋裕?1、補體的溶血反應(yīng) -補體參與的反應(yīng)原理 綿羊紅細胞

2、（SRBC）作為抗原與其相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合后，通過經(jīng)典途徑激活補體，產(chǎn)生膜攻擊作用，最后導致紅細胞溶解，發(fā)生溶血反應(yīng)。 5孔號 SRBC溶血素補體NS13滴3滴3滴3滴23滴3滴6滴33滴3滴6滴43滴9滴結(jié)果 實驗步驟及結(jié)果判斷6陰性陰性陽性溶血溶血不溶血反應(yīng)系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反應(yīng)補體結(jié)合試驗補體2、補體結(jié)合試驗 -補體參與的反應(yīng)原理712345反應(yīng)系統(tǒng)AbAg補體CNS 搖勻，37C水浴，30mins指示系統(tǒng)溶血素SRBC 搖勻，37C水浴，30mins 反應(yīng)體系與結(jié)果判斷結(jié)果溶血結(jié)果否是是是否羊紅細胞對照8Part T細胞數(shù)量及其功能檢測91. E花環(huán)形成試驗 原理 人外周血T細胞表面

3、具有天然的能與綿羊紅細胞(SRBC)表面糖肽相結(jié)合的受體（E受體） ，可結(jié)合SRBC形成花環(huán)樣細胞團。 因為T細胞的異質(zhì)性，它們對綿羊紅細胞的親和力不同，所以T細胞可以形成不同類型的E花環(huán)，如EtRFC （總花環(huán)） 、 EaRFC （活性花環(huán)）、 EsRFC （穩(wěn)定性花環(huán)）等。 檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的細胞免疫狀況 。CD210實驗器材肝素抗凝血、綿羊紅細胞（SRBC）淋巴細胞分層液、Hanks液、1640培養(yǎng)液、0.5戊二醛固定液、燦爛甲酚蘭染液試管、滴管、離心機、微量移液器、玻片、顯微鏡等11 實驗步驟密度梯度離心法分離外周血單個核細胞：取稀釋好的人外周血，用滴管貼管壁（傾斜30）輕

4、輕疊加于2ml分離液上（界面要清晰） 配平后2000rpm離心 10mins。離心后分為5層，由上8而下分別為：稀釋的血漿、單個核細胞、分離液、粒細胞、紅細胞。 1. 淋巴細胞懸液的制備：動作輕柔；分清滴管及槍頭！12稀釋的血液 分層液離心前稀釋的血漿 單個核細胞分層液粒細胞紅細胞離心后13 洗滌細胞：另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細胞，放入盛有5mlHanks液的試管2000rpm離心5mins。棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細胞輕彈混勻后加入Hanks液5ml，重復(fù)離心一次。2. 棄去上清，留經(jīng)過洗滌的淋巴細胞懸液0.1ml與綿羊紅細胞0.1ml 、

5、1640營養(yǎng)液0.1ml混合輕彈混勻后放于37溫箱15mins。143. 取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢）室溫靜置3-5分鐘。4. 取出試管，吸去半量上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5. 取25ul液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。6. 顯微鏡下觀察。15E花環(huán)形成實驗（燦爛甲酚蘭染色，400）實驗結(jié)果16 高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花環(huán)形成率。淋巴細胞上結(jié)合3個SRBC者為E花環(huán)陽性。正常參考值：EtRFC：64.46.7； EaRFC：23.63.5； EsRFC：3.32.6 實驗結(jié)果172

6、. 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 原理T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，稱淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機體的細胞免疫水平，故可作為測定機體免疫功能的指標。常用方法形態(tài)學方法3H-TDR摻入法MTT比色法18 胞核的大小、與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造與核仁的有無成熟小淋巴細胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；淋巴母細胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁1-2個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細胞：中性粒細胞在培養(yǎng)72小時后，絕大

7、部分衰變或死亡呈碎片。(1)形態(tài)學方法 -淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 鏡下結(jié)果19紅細胞未轉(zhuǎn)化淋巴細胞轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 瑞氏染色 10100 實驗結(jié)果20淋巴細胞轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)換的淋巴細胞轉(zhuǎn)換的淋巴細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞100正常參考值：80213H-TDR摻入法 -淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 T細胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細胞進入S期，此時在細胞培養(yǎng)液中加入氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷（3H-TDR），可以被細胞攝入而摻入DNA中，通過-液體閃爍計數(shù)器測定3H-TDR的摻入量，判斷細胞的增殖程度。 22MTT比色法 -淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 MTT為一種黃色可溶性物質(zhì)，細胞活化增殖時通過線粒體能

8、量代謝，將MTT代謝成藍紫色的甲臢，沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，形成甲臢的量與細胞活化增殖的程度呈正比。甲臢經(jīng)鹽酸異丙醇溶解后呈紫藍色，置于酶標儀下根據(jù)顯色程度即可知道甲臢量并反映細胞活化程度。23 MTT Formazan Insoluble24 細胞上的CD分子相應(yīng)鼠抗人單克隆抗體兔抗鼠IgG熒光抗體反復(fù)洗滌，熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)陽性細胞。 間接免疫熒光法洗滌抗體熒光標記抗Ig抗體間接法3.T細胞亞群檢測 25間接SABC-AP法 SABC：鏈霉親合素生物素復(fù)合物 AP：堿性磷酸酶 生物素活化后可以標記抗體和酶，且不影響它們的活性；鏈霉親合素同一定濃度的生物素、酶混合后，就能形成鏈霉親合素(

9、SA)-生物素(B)-酶(E)復(fù)合物(SAB-EC)。這種復(fù)合物中至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親合素結(jié)合位點，可與生物素標記抗體結(jié)合。 3.T細胞亞群檢測 26 基本過程間接SABC-AP法 - T細胞亞群檢測 CD分子T細胞一抗（小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子mAb）二抗（生物素化）SABC（標有AP）底物-AP-APAP -27T細胞亞群檢測（免疫組化，400）28 補體參與的反應(yīng) 補體的溶血反應(yīng) 補體結(jié)合試驗 T細胞數(shù)量及其功能檢測 數(shù)量檢測 E花環(huán)形成試驗 T細胞亞群檢測：間接免疫熒光法 免疫組化法-SABCAP法 功能檢測 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗：形態(tài)學方法 3HTDR摻入法 MTT比色法 小結(jié)綜合性實驗免疫血清制備及應(yīng)用不但要注意實驗怎么做，還要知道該試驗的用途。29溶血