DNA測(cè)序操作步驟

1、 PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物10ng/pL。3ng3-10ng5-20ng10-40ng40-100ng50-100ng100-500ng0.5-1pg3pgDNA測(cè)序操作步驟BigDyeTerminatorkitv3.01DNA模板的純度與用量要求DNA純度：OD26o/OD28o=1.62.0。DNA濃度：質(zhì)粒200ng/pL,DNA用量：PCR產(chǎn)物100-200bp200-500bp500-1000bp1000-2000bp2000bp單鏈DNA質(zhì)粒，雙鏈DNACosmid,BAC細(xì)菌基因組DNA2.測(cè)序反應(yīng)以下加樣量以質(zhì)粒測(cè)序?yàn)槔?。測(cè)序PCR產(chǎn)物請(qǐng)按上面表格調(diào)整DNA用量，其余條件不變。Co

2、smid、BAC和細(xì)菌基因組DNA等大分子測(cè)序需使用40pL反應(yīng)體系，所有成分用量加倍。詳細(xì)說(shuō)明請(qǐng)參見(jiàn)BigDye英文手冊(cè)。所有試劑從冰箱中取出融化后，稍稍振蕩，離心，然后使用。PCR反應(yīng)的操作在冰上進(jìn)行。試劑用量DNA(200ng/pL)1pLBigDyeMix8pL引物(3.2pmol/pL)1pL滅菌去離子水10pL20pL總體積測(cè)序PCR熱循環(huán)條件：(96C10sect50C5sect6094min)x25個(gè)循環(huán)t4保溫測(cè)序產(chǎn)物純化96孔板法每管加入80,LNaAc/酒精混合液，室溫放置15min,最高速(2000-3000 xg)離心30min(離心機(jī)需要配置96孔板轉(zhuǎn)頭)；馬上倒置

3、96孔板，50 xg離心1min；加入150,L70%酒精，最高速(2000-3000 xg)離心15min；倒置96孔板，50 xg離心1min；重復(fù)第2步1次。讓殘余的酒精在室溫?fù)]發(fā)干，加入10,LHi-DiFormamide溶解DNA。5溶解后的樣品需要在95C變性4min,迅速置冰中冷卻4min后，再上樣電泳。測(cè)序產(chǎn)物純化離心管法每管加入80,LNaAc/酒精混合液，室溫放置15min,最高速(12000 xg)離心30min。離心沉淀后，馬上去掉酒精：先輕輕倒去大部分上清液，然后用槍吸去殘余的上清液(約20,L)。加入250,L70%酒精，最高速(12000 xg)離心15min；離心沉淀后，馬上去掉酒精：先輕輕倒去大部分上清液，然后用槍吸去殘余的上清液(約20,L)。重復(fù)第2步1次。讓殘余的酒精在室溫?fù)]發(fā)干，加入10,LHi-DiFormamide溶解DNA。5溶解后的樣品需要在95C變性4min，迅速置冰中冷卻4min后，再上樣電泳。試劑配制3MNaAc,pH4.6溶液的配制102.06gNaAc3H2O溶于200mLdH2O中，用冰醋酸調(diào)pH至4.6，定容至250mL，分裝，高壓滅菌消毒，室