癲癇動物模型

1、癲癇的動物模型、簡介癲癇癥是最常見的神經系統(tǒng)疾病之一,其患病率在一般人口中每100隊約有5人。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的定 義，癲癇癥是由先天或后天不同因素所引起的慢性腦疾病，其特征是反復性驚厥發(fā)作，伴隨不同的臨床和腦電圖 的表現(xiàn)。因此，癲癇癥(epilepsy)是一反復發(fā)作的臨床候群，而因一W生異常的一次腦細胞放電所引起的神經 系統(tǒng)功能失常稱為，原厥(Seizure),驚厥是M際的行為活動，一次驚厥發(fā)作不一名!示有癲病癥。目前，國內所用的癲癇分類方法是以國際抗癲癇聯(lián)盟(ILAE)1981陰口 1985年的分類法。但為了兼顧臨床 和實驗室研究，本章所討論的癲癇現(xiàn)象主要根據(jù)1981年的分類，此分類法主要

2、以臨床表現(xiàn)及EE依據(jù)將癲癇 分為：全身性和部分性癲癇。迄今研究人類癲癇的發(fā)病機理仍主要依靠動物實驗，癲癇產生機制的探討及最新進展亦多直接或間接來于 動物模型研究。目前已有數(shù)十種動物模型應用于癲癇研究，選擇適宜的實驗模型取決?所需解決的問題、所需的 癲癇類型，與臨床發(fā)作的T性以及是否簡單可靠。因此，選擇適當、有價值的癲癇動物模型是有效研究巔癇機 制及治療的捷徑?，F(xiàn)已發(fā)展并建立了類似臨床癲癇類型的多種癲癇模型(表I),包括整體與離體、腦片與細胞模 型，為探討癲癇形成的機帶吸觀察藥物治療療效提供了有利的工具。然而，如何合理、適當?shù)貞眠@些動物模型 是我們進行研究時首先應當考慮的，否則既浪費時間、精力

3、與錢財，又不能得到可靠的結果。以下分別介紹各種 類型癲癇動物模型的利與弊。1.急性簡單部分性表面致驚劑青霉素荷包牡丹堿印防已毒3.1.急性簡單部分性表面致驚劑青霉素荷包牡丹堿印防已毒3.復雜部分性卡因酸Tetanus toxin點燃4.6.腦組織海馬腦片原代分離細胞培養(yǎng)人類神經組織全身強直-陣攣 7.癲癇持續(xù)狀態(tài)士的寧膽堿能藥物 急性電刺激 去除癇持續(xù)狀態(tài)士的寧膽堿能藥物 急性電刺激 去除GABA 新皮層腦片2.慢性簡單部分性 皮層埋置金屬 氫氧化鋁鉆鴇鐵冷凍損傷聽源性驚厥小鼠Totterer 和 E1 小鼠遺傳性癲癇易感大鼠蒙古沙土鼠最大電休克化學致驚劑代 謝 性 derangements5

4、.全身性失神神經節(jié)甘脂抗體注射 靜脈注射致癇劑二急性簡單部分性癲癇慟1這類模型1組急性皮層損傷所致的驚厥放電。在臨床這樣的損傷如顱內膿腫、腫瘤或血腫可引發(fā)驚厥， 然后發(fā)展為慢性隱匿性反復性發(fā)作。而動物模型只出現(xiàn)單次原厥，不發(fā)展為慢性驚厥。造成這類模型的方法較多，如給予大腦皮層表面致驚劑：青霉素、荷包牡丹堿、印防已毒（為抑制性神經遞 質GABAB劑），或直接急性電刺激皮層組織，或消除抑制性神經遞質GAB或以化學致驚劑誘發(fā)新皮層腦片放 電等方法。其中應用最廣泛的是以青霉素涂于動物大腦皮層麥面的方法，即以含1.7-3.4mMT霉素棉棒涂于大 鼠或貓的腦皮層，數(shù)分鐘后即可記錄到病灶區(qū)的發(fā)作性、單向反復

5、性、傾向同步化的棘波放電，此模型適合研究 ，IW活動白怖散和癲癇產生的神經元基礎等問題。研究表明彳崎J量的青霉素放于培養(yǎng)中的神經元、麻醉動物的大 腦皮層或海馬腦片中可選擇性阻斷GABA導的抑制性突觸后電位（IPSPs）,而高劑量的作用則缺乏特異性。急性模劈勺缺點是：（1）每種藥物有各自特性，而此特性與癲癇產生的關系甚少，如青霉素酶可拮抗青霉素 慟的癲癇，但不能拮抗其它類型的癲癇產生，（2）急性模型的建立是依靠強烈的刺乳 病灶中許多細胞參與癲 癇活動，其參與程度大大超過人類病灶的實際神經元數(shù)量，（3）急性慟1僅持續(xù)數(shù)分鐘到數(shù)小時，而不導致反復 性原厥，并且，慟1無臨床病人組織中常見的神經元，樹突

6、，膠質細胞和局部神經環(huán)路形態(tài)學的病理改變，（4） 建立此模型時，動物需要麻醉，而麻醉可能影響實驗。三、慢性簡單部分性癲癇核型此類模型白鍵立方法包括：在貓或候的腦皮層植入二價金屬離子（氫氧化鋁、鉆、鋅、鴇等）、冷凍損傷、 注射神經節(jié)f脂抗體、靜脈給予致驚劑等，其中最有瓶勺和實際的癲癇模型是在腦內植入二價金屬離子產生“自 發(fā)性”放電狀態(tài)的簡單部分性，原厥，如：在猴子或貓的新腦皮層適當部位注射4%氫氧化鋁，在一到二周后可產 生自發(fā)的反復性驚厥，這種狀態(tài)可持續(xù)數(shù)年。此類癲癇模W勺發(fā)作行為、發(fā)作間發(fā)作后EEG病！改變及抗痛藥 物效果均近似人類簡單部分性癲癇。如：鋁離子損傷可誘發(fā)對側的面部或肢體末端抽搐，

7、偶爾也發(fā)展成為全身性 強直陣攣性驚厥,發(fā)作期與間歇期的腦電圖特征與臨床病人類似，神經病理顯示膠質細胞增生、神經樹突扭曲。 該模型的優(yōu)點是適于研究從腦病理損傷，癲癇產生，直至發(fā)展全過程中的機理。四、復雜部分性癲癇慟1復雜部分性癲癇通常起源于邊緣系統(tǒng)，包括杏仁核、海馬、顆葉新皮層等結構，目前常用的模型包括卡因 股致驚、破傷風毒素致驚、點燃致驚模型。由于點燃模型是目前被公認為研究腦細胞興奮B、可塑性及長時程增 強（LTP學習與記憶等問題的最實用的動物模型。以下重點介紹點燃慟1的建立方法。點模型點燃是指給？某一腦區(qū)重復的亞IW強度的刺激（通常是電刺激）造成正常動物強直-陣攣性原厥的過程。 點燃一旦建立

8、，這種腦細胞及原厥行為的敏感性可長期維持，及至動物終身。點燃動物在腦電活動的特征是后放 電（afterdischarges）。除了后放電以外，點燃動物還表現(xiàn)為后放電的閾值降低。因此，點燃的實質是出現(xiàn)長時 程的廣泛的腦電圖的原厥（后放電）伴隨行為驚厥及后放電閾值降低。電刺激是誘發(fā)后放電最簡單方便的方法。?電刺激部位大多在邊緣系統(tǒng)包括：海馬、內嗅皮層、梨狀皮層、新腦皮層和基底部結節(jié)，而杏仁核是最常 用的點燃部口 因其所需的刺激次數(shù)火大約14次），在杏仁核、海馬和新腦皮層通過司機激誘發(fā)的腦電及行為 ，IW模型各不相同。杏仁核誘發(fā)出的后放電時程較短（大約1A15秒），而海馬誘發(fā)的后放嶺長（大約2560

9、 秒）并伴有典型“濕狗樣色T的行為改變，如果反復給予電刺激最終都可誘發(fā)強直-陣攣性驚厥。由于點燃過程中的一些現(xiàn)象及行為表現(xiàn)與人類復雜部分性癲癇相似，如：皮層內電極記錄的EEGE現(xiàn)，相 似的驚厥行為表現(xiàn),并者阿誘發(fā)全身性，原厥，以及對傳統(tǒng)抗癲癇藥物如安定、苯巴比妥、苯妥英鈉、Valproicacid 都具有的敏感性等，近年的研究發(fā)現(xiàn)，點燃能導致海馬內神經元脫失，苔群纖維出芽和突觸重建，膠質斑展形成 等，提示該模型與人類復雜部分性驚厥的相似性。點燃模型的優(yōu)點：建立該模型較方便，并且一旦建成若其腦內高度興奮性神經元司永久存在，并可探討癲 癇W究中的三個核心問題：（1）神經高度興奮成伽制?（2）高度興

10、奮W可保持？（3）高度興奮W可發(fā)展？對這 些問題的解釋有利于更有效的治療、預防癲癇的發(fā)生與發(fā)展。最常用的點燃方法是以電刺激杏仁核（在各類動物均可，常用大鼠），在杏仁核植入雙極電板，手術后一周, 每天給予電刺激（常規(guī)為0.2 1.0mA,60Hz,2秒），大致12周內可記錄至時電刺激產生的后放電后，放電逐 漸趨于延長復雜化，此時，可稱為點燃建立，在以后的數(shù)周內，動物表現(xiàn)為“自發(fā)性”的癲癇也原厥，即正常的 腦細胞傳入刺激亦可激發(fā)后放電。Racine艮據(jù)點燃過程中動物原厥表現(xiàn)將點燃狀態(tài)分為V級：I級：面部陣攣， II級：面部陣攣伴節(jié)律點頭，III級：面部陣攣、點頭、單肢陣攣、IV級：III級+后肢站

11、立，V級：IV級+跌 倒。？IV和V級可作為繼發(fā)隹全身也堪癇模型。（一）、材料體重 30cH 32誠的雄性 SD（Sprague-Dawley鼠.動物定位儀.四導生理記錄儀.生理計數(shù)器.雙極電極（饃銘含金、直徑254um）直徑、電阻.恒溫冷凍切片機（二卜電極岬以50mg/k或巴比妥，腹腔注射麻醉動物。將麻醉后動物固定于立體定位儀上，保持前后因在水平面。 于頭顱正中縱向切開皮膚，止血，分離顱間肌肉，骨膜以3%HO脫脂，務使顱骨表面保持干燥。右側杏仁核立體 定位座標為：前因中后0.8mm中線右側4.8mm項端表面垂直進入深度8.5mm鉆孔、插入電極，再以牙科水泥 固定電極。觀察呼吸、循環(huán)1小時。點

12、燃實驗于動物恢復TW后進行。（三卜電刺激與參數(shù)電刺激每 12次，刺激參數(shù)：單機方法、0.11.0mA 60Hz 12秒。每次刺激后，立即用同一電極 記錄腦電、并觀察記錄動物行為。動物驚厥達V級時可稱為點燃（Kindled）,連續(xù)5次V級的原厥被稱完全點燃（FullyKindled）。（四）、驚厥閾值的測定在1分鐘內連續(xù)0.1mA的電刺激及遞加0.1mA首次誘發(fā)出后放電時的電流量稱為后放電閾值 （afterdischargesthreshold,ADT%慢性點:燃是以低于后放電閾值的電流刺激動物某內核團，直到動物被點 燃。全身驚厥閾值（generalizedseizurethreshold,GS

13、T）i指在完全點燃動物中，每天給予穩(wěn)定的刺激強度，連 續(xù)四天都可造成4或5級原厥，GSTT應用于抗癲癇藥物治療效果的監(jiān)測。（五卜組織學檢查點燃部位以戊巴士接鈉麻醉后，剪開胸腔，以生理鹽水心臟灌流，再以4%多聚郵灌流，430分鐘。剪碎顱骨， 搭I取出腦組織，液氮內冷凍后，于20C恒冷箱切片機內平衡溫度，切片（12um）檢查叫尖端位置，肉目必 察或克紫染色在顯微鏡下觀察電極周圍神經細胞情況。（六）傳統(tǒng)的點燃方法認為，串間間隔低于20分鐘的電刺激不能使動物點燃，神年來國外文獻報道：低于20 分鐘的串間間隔的電刺激也同樣能使動物點燃，并使點燃所需時間明顯縮短，點燃動物M有與傳統(tǒng)點燃一樣的屬 性，稱為快

14、速點燃。除刺激參數(shù)外其余的方法與傳統(tǒng)自燃一樣。刺激參數(shù)：頻率16Hz波寬1ms串長10s,串間間 隔5min強度400uA恒流脈沖刺激。五、全身也雖直一陣攣f生原厥慟!！這類模型包括遺傳性全身性驚厥動物模型、最大電休克模型、化學藥物致原慟1。目前應用較多的是遺傳 性動物，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)與人類的發(fā)T4全身強直陣攣，也羸癇近似的動物慟1。從各種遺傳雙種系中所選動物, 其誘發(fā)癲癇發(fā)作所用的刺激，以及它們伴有的非原厥性異常均與人類不同。理想的25次/秒間歇閃光刺激敏感 的狒狒癲癇模型，因價格昂貴難于管理而不實用。目前多用遺傳性癲癇易感小鼠及大鼠模型，并已有專門的實驗 室進行同種近親繁殖的種系（如美國J

15、ackso偵驗室）。Noebel近年已證實在1種伴自發(fā)驚厥及5種對感官刺激 驚厥易感的小鼠系中，每種均由單基因位點突變引起。如聽源性驚厥（1216Hz鈴聲誘發(fā)）易感的DBA/2J（audiogenicseizures,AGS）,TottereT鼠系等。DBA/2J勺易感性在生后24周最高，按發(fā)作行為不同 評分，EEGHW跑期0不易記錄，近年通過廣泛神經生化研究發(fā)現(xiàn)可育瞅少鈣依賴的ATPWo Totterer（tg/tg） 小鼠表現(xiàn)出癲癇及EEGI常并同時有遺傳性共濟失調，已證實其海馬及藍斑等區(qū)N掰濃度及神經末梢發(fā)量增多。 在大鼠中，遺傳f生癲癇易感大鼠（geneticallyepilepsyp

16、oonerat,GEPRjW源性刺激、高溫、電、化學及點燃等 刺激誘發(fā)的癲癇均易感，較小鼠更適宜于電生理研究?，F(xiàn)今國際常用的GEP是從S狄鼠中分離出的，分為高度 易感的GEPR9及中度易感白GEPR3,均以出生后24周易感性最高。1977年由北京醫(yī)科大學藥理教研室從Wiatar大鼠中篩選出的一種對聲音刺激易感的驚厥大鼠P77PM密 過2代以上近親交配，保留繁殖。P77PMC鼠的驚厥易感性具有兩種特性：遺傳性；（2）刺激誘發(fā)全身發(fā)作性 驚厥的易感性，該鼠系具有與國際通用的GEP相同的特性。GEP勘物表現(xiàn)的原嬲寺性與人類巔癇類似，首先，可表現(xiàn)自發(fā)性驚厥，（EEGa察）,其次低劑量的某些藥 物可誘發(fā)

17、強烈的驚厥，再次，對外界刺激（聲音刺激）的易感性。已發(fā)現(xiàn)GEPR：鼠腦內*乏存在X茶酚胺介質改變，興奮及抑制性神經遞質改變，幼年GEPR丘處GABA 合成酶GAD疫反應陽性神經元顯著增加等，并且推測下丘是其驚厥起發(fā)點，而前腦班珞是該鼠衍化為全身強直 陣攣性原厥的關鍵部位。遺傳性動物慟1較人工致成癲癇更符合自然性，并有助于探討驚厥活動的產生及傳播 通路及各腦區(qū)神經遞質、調質的變化情況。人工致全身性癲癇模型的化學藥物見（表II）。最大電休克滋（Maximalelectroshock,MES是歷史悠久的模型，電流（小鼠50mA大鼠150mAi過耳殼或角膜也吸產生暈厥，面部及前肢陣攣為最小電休克，產生

18、后肢強川生伸展及屈曲繼m陣攣W為MES適于篩選抗W藥。凡可挪|J ME宓藥可作為治T全身也巔W候選藥物。表II :全身性化學致癇劑藥物動物劑量及給藥途徑(mg/kg)PTE (戊四口坐)小鼠85 S.C ,50 -75i.p. ,50i. v大鼠70 S. C ,40 i.p貓20 i.v青霉素大鼠60 萬 IU,肌注貓30 萬 IU ,肌注美解眠 9 bemegride )大鼠21 i.pER 防已毒(picrotoxin )小鼠3.2 S.C.狗2.0 i.v荷包 牡丹堿(bicuculline)小鼠2.7 S.C.猴0.3 i.v士的寧(strychnine )小鼠1.5 S.C.MSD

19、大鼠200 i.p烯丙基甘氨酸狒狒550 i.v三氟二酸小鼠1.5 ml全吸入同型脫氨酸(homocysteine)小鼠875 i.pN - methyL-DASP (NMDA)小鼠340S.C. , 105 i.v(弓I 自 Fisher RS. Brain Rec. Rev 1989 ; 14 : 245 - 278 )六、全身失W性癲癇遺傳性先申性癲癇大鼠(GAER)一種Wistar大系雜交而得，經三次交配以后，10a的成年大鼠有自 發(fā)性驚厥，其特點為瞪眼，運動停止，跌倒、擺動樣抽動。EEGI現(xiàn)為發(fā)作日7-11HZ勺棘波放電，持續(xù)0。5- 40秒，發(fā)作間期正常。GAE的自發(fā)性原厥與年齡有

20、關，隨年齡增長原厥頻率增多，持續(xù)時間延長。雌鼠較雄鼠 的原厥發(fā)生率高。丘腦與皮層的相互作用與驚厥的發(fā)生有關，黑質及皮層網(wǎng)狀系統(tǒng)對其發(fā)病有調節(jié)作用。GAER 的原厥機帶愎雜，結論不一，可能與GABAVL茶酚胺類神經介質異常有關。七、體外培養(yǎng)中的腦組織、腦片或細胞癲癇模型的產生海馬腦用0.5mm或手術切除的人類癲癇病灶，在體外以人工腦脊液CSF學育可存活18小時以上，因無血 腦屏障及麻醉影響，適于細胞內電生理研究如海馬CA3田胞起搏點，PDS離子及電生理機制等，有助于了解發(fā)作 間與發(fā)作期的過渡。體外腦細胞原代分離單層培養(yǎng)是將胚胎或新生動物不同腦區(qū)組織通過機械及酶處理后，接種 于平面培養(yǎng)皿中，細胞可

21、在體外培養(yǎng)中存活發(fā)育，亦可形成突觸。適于研究細胞一細胞間的聯(lián)系，并通過斑片鉗 技術在單個神經元研究膜、離子通道及突觸功能與癲癇產生的關系及各種影響因素。缺火是存在機械損傷及缺血 缺氧等因素影響。以下著重介紹頹葉皮層腦片制備及電描記方法。腦片研究的優(yōu)點是（1）腦片內的神經網(wǎng)絡是有限的，其放電活動必然來源于這些神經網(wǎng)絡，而非其它部位的 投射；（2）腦片的環(huán)境是可控的，易改變灌械的離子濃度和氣體含量，并且易檢測給藥的細胞外環(huán)境濃度。 顆葉腦片彳瞄!誘發(fā)放就莫型的建立：（一）、顆葉皮層腦片解剖顆葉皮層腦片包括新皮層顆葉皮層3區(qū)（Te3）,內嗅皮層（EC）,齒狀回，海馬CA1 CA軌等（圖1）。內嗅 皮

22、層（EC藤受來自不同的新癡皮層區(qū)，皮層下結構、邊緣系統(tǒng)如腦干結構的投射，再投射到海馬結構。內嗅皮層 襁元投射通過穿行通路到海馬齒狀回顆粒細胞，顆粒細胞發(fā)苔葬樣纖維投射到同側齒狀回門區(qū)神經元，及CA3 區(qū)錐體神經元，CA數(shù)錐體神經元再發(fā)出軸突投射到CA1K錐體神經元、內嗅皮層到海馬的侵入活動就是以此三 角形突觸好式完成的。內嗅皮層分6層：1、叢狀層，2、衛(wèi)星細胞層，3、表淺錐體細胞層，4、深錐體細胞層， 5、小錐體細胞層，6多形細胞層。圖1、成年大鼠顆呻胸片解剖水平示意圖（二卜顆葉皮層腦片制備:急性斷頭，打開顱骨,分離硬腦膜,分離全腦并快速放于35c預冷的人工腦脊液（ACS叩,ACS成分（mM）

23、 為：NaCl124.0 Kcl3.0,MgSO41.8,CaCl21.6,NaH2PO41.3,NaHCO326.0,Glucose10.0,PH7.皿7955 o25%co2平衡。去除小腦，切開兩側半球，大腦半球的中間切面朝r入在濕潤的濾紙上，切除大腦半球的前 三分之二部分，然后將后三分之一部分切面朝下放在組織切片機側刀的小盤上，除支基底部分的四分之Tfi織， 精細切下68片400um勺腦片。該腦片包括的結構有：酸葉皮層小區(qū)，內嗅皮層，大腦腳和海馬結構（圖2）。圖2。制備頸葉腦片水平示意圖（三卜灌流液及灌流槽：將腦片放F聚氯乙烯灌槽小室內的聚胺篩網(wǎng)上，用預熱（35。C）,以蠕動泵將（95%O2-5%CO2ACS峙續(xù) 灌流，1小時左右，使腦片活f怵本恢復生理狀態(tài)爾后在內嗅皮層IV-V層或CA1Kg它區(qū)插入刺激詠或 細胞內，外記錄電極或離子敏感電極，記錄各區(qū)放電情況，將結果記錄在描記紙上進行分析。圖3。無Mg2+工腦脊液誘導顆葉腦片放電八、癲癇持續(xù)狀態(tài)許多化學致原劑大劑量給予可使嚙齒類動物出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，如：卡因酸、*甲基-天門冬氨酸、 戊四瓶 六氟二乙酯、荷包牡丹堿等。近年，應用較普遍的癲癇持續(xù)狀態(tài)的慟1是大鼠鋰一匹羅