蛋白質(zhì)分分離純化與表征

1、關(guān)于蛋白質(zhì)分分離純化和表征第一張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子中有很多酸性和堿性解離基團(tuán)，是具有兩性解離性質(zhì)的化合物。各種解離基團(tuán)的解離度與溶液的pH有關(guān)，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質(zhì)分子帶正電荷越多，負(fù)電荷越少；pH升高，則解離情況相反。 第二張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月等電點(diǎn)（pI）: 在特定pH條件下，某種蛋白質(zhì)分子所帶正負(fù)電荷相等，靜電荷為零，這一pH 稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。幾種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)第三張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 等電pH并不是一個(gè)恒定的值，它會(huì)因溶液中鹽的種類和離子強(qiáng)度的影響而有所不同。 等離

2、子點(diǎn)(isoionic piont): 蛋白質(zhì)在純水溶液中的帶電狀態(tài)則沒有其他離子干擾，完全由H+的解離和結(jié)合來決定，這種條件下的等電點(diǎn)稱為等離子點(diǎn)。等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)的特征性常數(shù)。第四張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質(zhì)的分子大小與分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量的范圍：61031106 Da。第五張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子量 用化學(xué)分析方法測(cè)出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量。并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中含有一個(gè)被測(cè)元素的原子，則可由此計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。 例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計(jì) 算二者的相對(duì)分子質(zhì)量。 最低相對(duì)分子

3、量 x 100 =鐵的百分含量 鐵的原子量0.335 55.8x 100=16700測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的原理和方法也可以利用蛋白質(zhì)中含量特少的aa，用同樣的原理計(jì)算蛋白質(zhì)的最低分子量。第六張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子量 滲透壓法測(cè)定Mr操作簡(jiǎn)單， Mr在10-100 kDa時(shí)較準(zhǔn)，但不能區(qū)別蛋白質(zhì)分子是否均一 。 滲透壓公式： Mr =RTlimc0c(c=質(zhì)量濃度，g/mol)第七張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）沉降分析測(cè)定Mr 在強(qiáng)大的離心場(chǎng)中，如果蛋白質(zhì)溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉降。 沉降速度決定于蛋白質(zhì)的分子

4、量、分子密度、分子形狀和溶劑的密度、粘度。 沉降系數(shù)（20,w）：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)的沉降速度。定義110-13秒（斯維得貝格單位） 沉降速度法 沉降平衡法第八張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）凝膠過濾法測(cè)定Mr 凝膠過濾（層析）可按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，同時(shí)可以測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve （Ve為洗脫體積） ，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測(cè)V測(cè)

5、第九張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）SDS法測(cè)定Mr 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。 當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時(shí)，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。 第十張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDS）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080

6、605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis第十一張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性 蛋白質(zhì)顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100 nm)。又由于其分子表面有許多極性基團(tuán)，親水性極強(qiáng)，易溶于水成為穩(wěn)定的親水膠體溶液。 蛋白質(zhì)親水膠體的穩(wěn)定性主要取決于兩個(gè)因素： 雙電層 水化層 a. 丁達(dá)爾效應(yīng) b. 布朗運(yùn)動(dòng) c. 不能透過半透膜三、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀第十二張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。

7、假若改變環(huán)境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質(zhì)親水膠體便失去穩(wěn)定性，發(fā)生絮結(jié)沉淀現(xiàn)象，這既是所謂的蛋白質(zhì)沉淀作用。 鹽析法（salting out） ： 中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等） 蛋白 質(zhì)脫去水化層。 優(yōu)點(diǎn)：不引起蛋白質(zhì)變性。 鹽溶（salting in）：稀鹽溶液中蛋白質(zhì)溶解度增 加的現(xiàn)象。第十三張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有機(jī)溶劑沉淀法： 極性有機(jī)溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）脫去水 化層以及降低介電常數(shù) 而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相 互作用。 條件：低溫操作，縮短時(shí)間。 重金屬鹽沉淀法：當(dāng)溶液pHpI,蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷,易與重金屬離子 (Hg2+,Pb2+,Cu

8、2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物堿試劑和某些酸類沉淀法： 生物堿試劑能引起生物堿沉淀的一類試劑。 當(dāng)溶 液pHpI時(shí),蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷 易與生物堿試劑, 酸根負(fù)離子反應(yīng)沉淀 用途：臨床除去體液中干擾測(cè)定的蛋白質(zhì)第十四張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月加熱變性測(cè)定法原因：加熱變性使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外 露，損壞了水化層 用途：制豆腐（加熱+少量鹽鹵）第十五張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1.定義： 在某些物理或化學(xué)因素作用下，天然蛋白質(zhì)嚴(yán)密的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失（如酶失去催化活力，激素喪失活性），則稱之為蛋白質(zhì)變性作用(denatu

9、ration) 。 有些蛋白質(zhì)的變性是可逆的，通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎㄈ缤肝觯⒆冃詣┏ズ?，蛋白質(zhì)可以恢復(fù)其天然立體結(jié)構(gòu)，這個(gè)過程稱為復(fù)性（renaturation）。 一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級(jí)鍵的破壞，只有空間構(gòu)象的改變，并不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)（共價(jià)鍵）的變化。四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性第十六張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)因素： 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、 生物堿試劑、尿素等 物理因素：加熱、射線、超聲波、劇烈震蕩等2. 變性因素第十八張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 旋光值改變 特性粘度增加 溶解度降低 擴(kuò)散系數(shù)降低 結(jié)

10、晶能力喪失 易于沉淀，若加熱還會(huì)凝固。但若遠(yuǎn)離等電點(diǎn) 則不一定沉淀 變性后蛋白質(zhì)肽鍵暴露而更加易于消化3.變性后蛋白質(zhì)的表現(xiàn)第十九張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月變性蛋白質(zhì)為什么能復(fù)性？ 在一定的環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)能夠決定二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。變性蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)雖然遭到破壞，但是一級(jí)結(jié)構(gòu)仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質(zhì)能卷曲折疊成為能量最低的構(gòu)象，一般天然蛋白質(zhì)正是具有這種能量最低的構(gòu)象。 第二十張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 根據(jù)分子量：如沉降速度法離心 根據(jù)密度：沉降平衡法離心 根據(jù)電荷和分子量：聚

11、丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)分子量和分子形狀：凝膠過濾 根據(jù)溶解度：硫酸銨分級(jí)沉淀、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀 根據(jù)電荷：等電點(diǎn)沉淀第二十一張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月六、蛋白質(zhì)的分離純化方法 透析：利用半透膜的選擇通透性來純化象蛋白質(zhì)這樣的大分子物質(zhì)的過程叫透析。 超過濾：是利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)分子被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的，有時(shí)要用切向流過濾法。（一）根據(jù)分子大小不同的分離純化方法第二十二張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠過濾法 凝膠過濾（層析）是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。 凝膠顆

12、粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來。第二十三張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）利用溶解度差別的純化方法 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。溶解度歸根結(jié)底取決于他們本身的分子結(jié)構(gòu)。 等電點(diǎn)沉淀技術(shù)：在等電點(diǎn)pH條件下，蛋白質(zhì)為電中性，其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、黏度、滲透壓等都表現(xiàn)為最低值，易

13、發(fā)生絮結(jié)沉淀。因此，等電點(diǎn)性質(zhì)常被用于蛋白質(zhì)的分離制備，被稱為等電點(diǎn)沉淀技術(shù)。第二十五張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 鹽析：當(dāng)離子強(qiáng)度增加到足夠高時(shí)，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質(zhì)可以從水溶液中沉淀出來，這種現(xiàn)象稱為鹽析。 有機(jī)溶劑分級(jí)分離法：引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是改變了介質(zhì)的介電常數(shù)。 溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響：0-40之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高而增加。第二十六張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）根據(jù)電荷不同的純化方法 電泳 ： 在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。原則上按電泳的原理來分，可分為：自由界面電區(qū)

14、帶電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 三種物理效應(yīng)：樣品的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)。第二十七張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N, N-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m第二十八張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Tris-Gly pH=8.3Tris-Gl

15、y pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%第二十九張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDS）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis第三十張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有

16、不同電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。 若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。 物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。離子交換：第三十二張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十三張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（六） 親和層析 親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時(shí)，此生物大分子便

17、與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的 。 抗原和抗體 激素和受體蛋白 凝集素和糖蛋白第三十四張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體第三十五張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月七、蛋白質(zhì)的含量測(cè)定與純度 測(cè)定蛋白質(zhì)的量是研究蛋白質(zhì)的最基本的一步。 溶液中蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定方法很多，最早的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，稍后應(yīng)用較廣泛的方法是雙縮脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年來大多數(shù)人用考馬斯亮藍(lán)法。（一）蛋白質(zhì)的含量測(cè)定第

18、三十六張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 雙縮脲法雙縮脲法是基于蛋白質(zhì)分子中的肽鍵，凡具兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)均會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)可以與Gu2形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關(guān)。第三十七張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 福林酚法福林酚法主要基于蛋白質(zhì)在堿性溶液中能與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物以及芳香族氛基酸殘基可以還原酚試劑而產(chǎn)生藍(lán)色，再與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(通常采用牛血清白蛋內(nèi))比色定量。福林酚試劑法靈敏度高，但是如果樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸差異較大時(shí)，會(huì)有較大的系統(tǒng)誤差。第三十八張，PPT共四十一頁，創(chuàng)作于20