CELL細(xì)胞培養(yǎng)的生長測定課件

1、細(xì)胞培養(yǎng)的生長測定第1頁，共23頁。 一、活細(xì)胞的觀察檢測方法 肉眼觀察 相差顯微鏡觀察 細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中需要每天觀察，以便及時了解細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無移動、有無污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃、是否更換等。 細(xì)胞常規(guī)檢查的方法為：第2頁，共23頁。第3頁，共23頁。肉眼觀察 一般常規(guī)檢查用肉眼即可觀察，主要看培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。pH 顏色 透明度 正常 7.27.4 桃紅色 清亮、透明酸性產(chǎn)物 變淺、變黃 污染 混濁 變黃 pH pH 變紅第4頁，共23頁。生長良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。若細(xì)胞生長狀態(tài)不良，可見細(xì)胞輪廓增強(qiáng)

2、，細(xì)胞折光性變?nèi)酰?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)第5頁，共23頁。BMSC(bone marrow stromal cells 骨髓基質(zhì)細(xì)胞 )第6頁，共23頁。第7頁，共23頁。Anip973（肺癌細(xì)胞）第8頁，共23頁。二、細(xì)胞計數(shù)計數(shù)方法有血細(xì)胞計數(shù)板人工計數(shù)；細(xì)胞計數(shù)器自動計數(shù)法 第9頁，共23頁。三、細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長曲線(cell growth curve)是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo),可用來分析細(xì)胞的增殖速度，確定細(xì)胞進(jìn)行傳

3、代及凍存操作的最佳時間。 第10頁，共23頁。How to make cell growth curve?1.培養(yǎng)細(xì)胞首先在培養(yǎng)板的21個孔內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞。計數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度。接種時間記為0h 第11頁，共23頁。2.計數(shù)細(xì)胞密度每隔24h計數(shù)3孔(瓶)內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。如此操作至第七天結(jié)束。 第12頁，共23頁。3.繪制曲線以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得第13頁，共23頁。第14頁，共23頁。四、體外活體染色觀察體外活體染色是在體外條件下用某種染色劑對活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動方法。原理：一般的生物材料不能

4、穿透細(xì)胞膜，只有當(dāng)細(xì)胞被固定后，細(xì)胞膜被破壞，染料才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。但活體染料卻能進(jìn)入活細(xì)胞，它們是一些無毒或毒性很小的染色劑，能使細(xì)胞中某些特定結(jié)構(gòu)著色?；铙w染料基本上不影響細(xì)胞的生命活動。第15頁，共23頁。1.活體染料的類別 堿性活體染料：詹納斯綠，中性紅，次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、亮焦油紫等酸性活體染料：臺盼藍(lán)，剛果紅 體外活體染色使用堿性活體染料（帶正電）第16頁，共23頁。2.臺盼藍(lán)排除檢測法(1)0.4臺盼藍(lán)溶液的配制：稱取0.4g臺盼藍(lán)(trypan blue)，加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至50m1，離心后取上清液，再加入1.8NaCl溶液至100ml，即成。 第17頁，共23頁

5、。染色步驟1)吸去培養(yǎng)液，洗滌。 2)加入活體染料，2min后觀察。第18頁，共23頁。3)在顯微鏡下觀察4)傾去染液。洗滌。5)加入培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)。第19頁，共23頁?；罴?xì)胞染料排除檢測法 由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入而使細(xì)胞呈色。鏡下，死細(xì)胞呈淡藍(lán)色，活細(xì)胞不染色。第20頁，共23頁。第21頁，共23頁。注意事項:細(xì)胞懸液放置時間過長,正常細(xì)胞可攝取染料,從而影響染色結(jié)果 第22頁，共23頁。一.填空題1血細(xì)胞計數(shù)板：有不同的型號，常用的是改良的紐巴氏(Neubauer)血細(xì)胞計數(shù)板。紐巴氏血細(xì)胞計數(shù)板有兩個計算室，各室劃分為-個大格，每個大格的平均面積為-。計算室上方蓋上血細(xì)胞計數(shù)板專用的蓋玻片后，室的深度則為-mm。用于血細(xì)胞計數(shù)時，白細(xì)胞用-，紅細(xì)胞用-。2體外活體染色就是在-條件下用某種染色劑對-進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動的一種方法。利用這種方法，可以對培養(yǎng)物進(jìn)行染色觀察，經(jīng)染色的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。二.名詞解釋細(xì)胞生長曲線 三.簡答題1簡述制作細(xì)