臨床實驗室質譜檢測原理介紹

1、臨床實驗室質譜檢測原理簡介臨床實驗室質譜(mass spectrometry,MS )技術在臨床實驗室中的應用隨著MS分析儀的創(chuàng)新不斷拓展。最早的MS分析儀采用扇形電場及磁場實現(xiàn) 質量分離，體積大、價格貴。隨著四極桿MS分析儀與色譜分離、第1代氣 相色譜(gas chromatography, GC)及液相色譜(liquid chromatography, LC)技術的聯(lián)用，大大提升了 MS技術的實用性。三重四極桿等多重MS技 術的聯(lián)用與LC分離技術令檢測向高敏、可重復、定量方向發(fā)展 這是目前臨 床實驗室開展MS檢測的基礎1。隨著MS分析儀的不斷發(fā)展及軌道阱(Orbitrap)MS分析儀的誕生

2、,LC-MS的聯(lián)用更是如虎添翼。采用GC/MS對類固醇2 及有機酸3進行檢測是MS技術最先在臨床實驗室 應用的項目。繼串聯(lián)MS檢測?；鈮A診斷新生兒遺傳代謝病(inborn error of metabolism, IEM)后，其在臨床檢測中的應用開始加速4o LC-MS聯(lián)用 尤其是與串聯(lián)四極桿MS聯(lián)用時，能實現(xiàn)對小分子藥物及其代謝產(chǎn)物的量化 檢測，促進了該領域儀器研發(fā)的進步5。治療藥物監(jiān)測與毒理學的迅速發(fā)展 在提升儀器靈敏度及實用性的同時，進一步擴大了 MS技術的應用范圍6。1儀器1.1 MS分析儀類型MS分析儀可對單個分子或分子片段進行質量分析，要求被分析對象帶電荷 并呈氣相，一般由緊密相

3、連的離子源、質量分析器及檢測器3個部分組成。 離子源外接樣品引入系統(tǒng)，是離子生成的部位；多數(shù)MS分析儀的質量分析 器根據(jù)離子質荷比(mass-to-charge ratio, m/z)區(qū)分離子；檢測器將離子 分別轉換成信號并傳入儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)控制整個儀器。MS技術具有較高的特異性，尤其在與可重復色譜分離技術聯(lián)用時，其檢測結 果可作為許多臨床檢測的“金標準。也就是說，該技術可作為其他特定分子 濃度檢測手段的校準方法。僅當某方法被作為參考方法且檢測嚴格按照書面 程序進行時，可將液相色譜串聯(lián)質譜(liquid chromatography tandem-mass spectrome

4、try, LC-MS/MS)作為金標準。但由于 MS 分析儀系統(tǒng)復雜、維持其精密度以獲得準確的結果亦具有一定難度,MS技術 常被視作“無其他方法可用時的最佳技術。MS分析儀根據(jù)m/z離子質量(相對原子質量)！電荷數(shù)分析被測物的質 量。例如,25-羥基維生素D3的相對原子質量為400,當加入1個質子 (400+1 )個質子而帶單電荷時，可在m/ z為401處被檢測到；當加入2 個質子而帶雙電荷時(400+2 )個質子402/2 = 201,可在m/z為201處 被檢測到。通常以m/z衡量準確度，檢測越準確則分子式鑒定能力越強。仍 以25-羥基維生素D3為例，其分子式為C27H44O2,分子離子經(jīng)

5、質子化后的 相對原子質量為401 (加入1個質子形成C27H45O2 ),其精確質量保留至 5位小數(shù)，為401.341 97。盡管經(jīng)質子化的C27H45O2(25-羥基維生素D3, m/z 為 401.341 97 )與 C28H49O (菜油甾醇,m/z 為 401.370 52 )之間的質量差異僅為0.028 55,但MS技術仍可通過m/z精確區(qū)分兩者。檢測誤差 決定了質量檢測結果所對應的潛在分子式的數(shù)量。高分辨質譜儀(high resolution mass spectrometer, HRMS)能精確離子 m/z。整體準確性及有效位數(shù)層面的質量檢測能力是區(qū)分不同類型MS分析儀的標 準之

6、一。為提升整體準確性,MS分析儀常采用四極桿作為質量過濾器。四極 桿由4根桿組成，以相對的2根桿為1組，通過在2組桿上施加相抵消的直 流電高頻電壓來實現(xiàn)質量過濾。許多MS分析儀都可提供準確的質量信息，如 檢測加速離子飛行時間的飛行時間(time of flight, TOF)MS分析儀7, 8, 檢測捕獲離子振蕩頻率的分析儀利用磁場捕獲離子的傅里葉變換質譜 分析儀(Fourier transform mass spectrometer, FTMS)與通過經(jīng)典吸引 平衡離子慣性進行捕獲的軌道阱MS分析儀9, 10, 11。多重MS技術的聯(lián)用令MS分析儀能夠在離子水平上同時進行多項臨床實驗。 由3

7、個緊密聯(lián)系的四極桿分析儀組成的三重四極桿較為常用，其常見的工作 模式見圖1 12。最簡單的模式是全掃描，在質量分析器設定的掃描范圍內采 集生成的全部離子的信號,Q1與Q3同時進行掃描,Q2設置為所有離子可通 過、不含碰撞氣體，見圖1(a);產(chǎn)物離子掃描可對不同質量的分子進行定 量檢測,Q1設置為僅特定m/z的離子可通過,Q2中充入碰撞氣體令離子碎 片化,Q3對片段產(chǎn)物進行掃描，見圖1(b);母離子掃描可用于確定一類待 測物中的所有母離子，識別共同碎片并觀察產(chǎn)生該碎片的所有母離子，由Q1 進行掃描，在Q2中通過碰撞氣體使離子碎片化,Q3僅識別特定m/z的離子, 該模式可檢測單個樣品中所有糖基化類

8、型，見圖1(c);與母離子掃描相近 的是中性丟失掃描，該模式對Q1與Q3同時進行掃描，將兩者質量抵消偏移, Q2中充入碰撞氣體進行離子片段化處理，可通過觀察m/ z為1（相當于水） 處的中性丟失情況來識別所有含羥基的離子，見圖1（d）;選擇反應監(jiān)測（selected reaction monitoring, SRM）為一種三重四極桿分析儀常用的模 式，可用于定量分析,Q1與Q3用于質量分析,Q2通過碰撞氣體進行碎片化 反應，見圖1（e）。SRM進一步升級即為多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring, MRM）, MRM以SRM為基礎，利用數(shù)據(jù)控制系統(tǒng)循序選擇多 重

9、反應類別。當MS分析儀連接色譜分離入口時，該模式尤顯重要。多重母 子離子對即母離子與碎片離子的組合，可在特定時間內對色譜洗脫出的特定 待測物進行監(jiān)測。如采用化學性質與待測物相同的同位素標記標準品，則標 準品與待測物的母子離子對同樣可通過MRM進行監(jiān)測。各母子離子對的觀 察時間短且與色譜層析圖譜峰寬相關，可準確測量峰面積并計算待測物濃 度。SRM與MRM的特異性大幅提升了試驗信噪比，提高了靈敏度。串聯(lián)四極桿可與精密質量儀聯(lián)用，較常見的包括Qq-TOF、Qq-FTMS與 Qq-OrbitrapQ代表掃描四極桿,q代表碰撞（碎片）四極桿。這類儀器可 運行上述所有模式，其檢測結果更為準確。1.2離子化

10、MS分析均以離子為基礎，故待測物經(jīng)MS分析儀檢測前需進行離子化，是 MS檢測的基本操作。MS分析儀采用過各類離子源，不斷推陳出新，就像許多MS分析儀曾風靡一時但如今不再使用一樣。 目前，臨床實驗室MS檢測常用的是LC技術,LC-MS檢測最常涉及的電離方 式有3種：電噴霧電離（electrospray ionization, ESI）、大氣壓化學電離（atmospheric-pressure chemical ionization, APCI）及大氣壓光電離（atmospheric-pressure photoionization, APPI）。（ 1）ESI 最為常用，盡 管工作機制尚未完全明

11、確，但重要的是ESI過程始于對預制離子液的霧化 13。液滴隨著溶劑分子的“揮發(fā)而不斷收縮，直至庫侖爆炸令其碎片化。 該過程持續(xù)至溶劑完全去除，留下帶電離子經(jīng)過錐孔（大小需滿足維持分析 過程中的真空需求）進入MS分析儀。同軸氣流可輔助霧化，附加氣流利于 溶劑蒸發(fā)，兩者均可提高流速。電噴霧常產(chǎn)生多種帶電離子，增加電荷數(shù)量可 提升MS分析儀的有效檢測范圍。（2）APCI采用LC流出物氣流輔助噴射 技術，通過電暈針放電令溶液分子產(chǎn)生活性成分，使待測物分子質子化或去 質子化，生成MS分析所需的帶電物質。（3）APPI同樣采用氣流輔助霧化，但 通過紫外線光源對待測物直接電離，或對摻入噴霧的助劑分子進行電離

12、從而 使待測物離子化。盡管APPI僅適用于含芳香基團的特定類型待測物，但其信 噪比極佳，故分析靈敏度非常高。這3類離子化技術均可與其他類型流體色 譜法聯(lián)用。ESI與APCI常產(chǎn)生質子化分子離子，通過向待測物添加1個質子（H+）來觀察帶正電荷的離子，或通過分子離子去質子化（去除H+）來觀 察帶負電荷的離子。APPI常通過丟失1個電子產(chǎn)生激發(fā)態(tài)陽離子。這3類離 子化技術均屬于“軟電離技術，主要產(chǎn)生準分子離子，通過檢測待測物中 所有特定m/z的離子來提高其靈敏度。GC是與MS分析儀最早進行聯(lián)用的 色譜技術14, 15,在臨床實驗室已有較豐富的應用經(jīng)驗，但該技術如今已不 及LC運用普遍。GC/MS采用

13、電子轟擊（electron impact, EI）電離技術，優(yōu) 勢在于不同儀器所獲得的結果重復性較好，能提供大量信息，可外接數(shù)據(jù)庫 能輔助鑒定化合物。與APCI相似,GC亦可向離子源中加入附加反應物，使其 離子化并反應生成可與待測物進一步反應的物質，經(jīng)質子化或去質子化形成 帶正電荷的陽離子或帶負電荷的陰離子。這種離子化形式亦稱化學電離(chemical ionization, CI),可減少化合物碎片質量的差異，常用于測定未 知物質的相對分子質量。并非MS技術分析的所有樣品都需要進行色譜分析。基質輔助激光解吸離子 化技術(matrix-assisted laser desorption/ion

14、ization, MALDI)常用于蛋 白、多肽、寡核苷酸及細菌檢測16。將待測物與吸收紫外汨ultraviolet, UV) 的基質溶劑混合，點樣于光滑金屬板上，干燥后放入MS源，一旦達到適宜的 真空狀態(tài)，斑點受脈沖UV激光照射會令少量待測物自樣品中釋出，反應生成 預形成離子或離子作為分析物進入MS分析儀。TOF MS電離呈脈沖性，常 用于檢測。MALDI可用于MS成像研究。另一類已成功運用于固體樣品電離的技術統(tǒng)稱為解吸電離17。該技術通過 ESI或APCI電離溶劑后導向固體樣品。電離溶劑與固體反應后令待測物解吸 并離子化，隨后導入MS分析儀。該技術已可用于干血斑(dried blood s

15、pot, DBS)18分析及MS成像。MS分析儀聯(lián)合電感耦合等離子體(inductively coupled plasma, ICP)炬 管可m成ICP-MS,能夠檢測金屬物質。該電離法采用高溫(10 000 K)氬氣等離子體氣流分裂樣品并電離。儀器可直接檢測樣品中的金屬物質，有 效開展重金屬中毒篩查19或聯(lián)合色譜分析明確待測物類別，提供有關金屬 物質化學環(huán)境的信息20。目前臨床化學色譜分析中廣泛采用的電離技術見 表1。表1臨床化學色譜分析常用電離技術的比較恚11球化學色譜分析常用電建投枷曲名稱色瑁法待測物類別待測物分子質量缺點曰GC日版性.可欄脩中辰星誨復性高與LC不兼容CIGCMB.可鈔G

16、C兼信息弓iLCE：客ESILC, SFG: CE極性中-高與許務生物樣品兼容受跟于坦離抵匍！APCILC, SFC CE彼性.投性鈕i較低中較 ESltEES晏APPILC, SFC CE含芳杏基團較低中高信噪比只能用于含渣舂皇團物質的撿測注:SFC為超臨界流體色譜supercritical fuid ctiromatography ) : CE為毛細管超派(capiliaryel ectropliores is)拽*號0 呈毋皿1.3樣品導入正如MS檢測采用各類離子源一樣，樣品導入技術同樣也有許多種。其中一 些基于分離輔助混合物分析，其他則側重于主體樣品，部分具有成像功能。臨床化學最常用的

17、2種色譜分析法為LC和GC, SFC、凝膠電泳、CE和凝膠 滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)等較少被采用21。除凝膠電泳外，其他方法均可通過表1中的電離技術直接與MS分析儀串聯(lián)。 SFC流動相多采用加壓二氧化碳，常用于手性分子分離22。CE同凝膠電泳 一樣利用電場進行分離，但在狹小的毛細管中進行23。GPC亦稱尺寸排阻 色譜(size-exclusion chromatography, SEC),常用于檢測較大生物分子， 與傳統(tǒng)LC不兼容24。LC技術正處在儀器根本性的變革中。2004年美國Waters公司推出了超高效液相色譜(ultra-per

18、formance liquid chromatography, UPLC)。該高 效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)系統(tǒng)泵 的最大工作壓力可達1 000 bar( 15 000 psi),較以往提升了 2倍，令柱化 學新技術得以被采用，尤其對于較小粒徑的物質，反過來提高了色譜分辨率 并減少了色譜運行時間。如上述，解吸技術可用于非成像檢測，也可用作二維 或三維樣品成像ICP可直接將樣品導入MS分析儀25,也可通過連接LC 加以實現(xiàn)19。LC-ICP-MS技術可明確樣品中金屬物質的種屬。1.4待測物類型、來源及用戶群體臨床MS檢測

19、樣品的制備根據(jù)MS分析儀的分析類型、待測物、進樣系統(tǒng)及 離子源而不同26, 27, 28, 29, 30。樣品類型與來源對樣品制備及預期的檢 測結果影響極大。樣品制備最簡單的方式是“稀釋后直接進樣”,正如其字面 意義，該法采用可溶溶劑對樣品簡單稀釋，常用于尿液檢測31;另一種稍復 雜的樣品制備技術是蛋白沉淀，該法將溶劑加入血液樣品，令蛋白凝聚并沉 淀常通過離心加強這一過程，一般無法去除樣品中的基質或脂質干擾。液- 液萃取是與既往技術相比具有一定優(yōu)勢的經(jīng)典樣品制備技術，但難以實現(xiàn)自 動化。固相萃取技術使用固化吸附劑吸附待測物，可徹底清除樣品中的基質 或脂質干擾32。固化吸附劑的親和力不同，需根據(jù)

20、樣品及待測物類型進行選 擇，未被吸附的干擾物經(jīng)洗脫后，要采用強溶劑再次洗脫待測物。成功制備樣 品的關鍵在于通過操作達到所需的樣品清潔度及充分的檢出限(limit ofdetection, LOD ）即可，超出檢測所需的制備操作會增加時間與成本。常用LC-MS/MS樣品制備技術的比較見表2。表2常用LC-MS/MS樣品制備技術的比較裹2制HLC-M引M溜盆!掀的岐優(yōu)點樣品話用性稀釋后直接進樣簡單、成技誠、快速清陶期底、m涸剝史樣品券釋鼠液帶m沉淀屏、g誠快速極低選擇性,無法消除基序F擾血液,血漿、血清液-液萃取真有分析物類特異性、瞰大濃盅制垃現(xiàn)自靴禰、血漿、皓簡單、快道（如實現(xiàn)自動化K易于嘛快性

21、眼夜、峽雷白質必旨質開發(fā).可血清快速如實現(xiàn)自動化）、回屋高、M方法開發(fā)宣雜.耕械本最裔所有種英樣品分析物類雖暗異性.可放大濃度注:各樣品若臨技術按表中由上至下1IS序建匚醐曾、易用性遂喊貿綁號莖因現(xiàn)GC-MS分析要注意的是：待測物應能夠利用GC熱揮發(fā)進行分離。如待測物 分子不揮發(fā)或受熱降解，則在保證樣品潔凈度的同時，還要進行衍生化處理 令其揮發(fā)33, 34。MALDI及其他未涉及色譜層析分離的技術采用不同的樣品制備方式。定量 MALDI與LC-MS/MS相似，常采用同位素標記內標加入已知濃度樣品。在 相同溶劑中溶解樣品與基質會帶來結晶、非必要沉淀等問題。微生物MS檢 測要求樣品制備方式有較高的

22、重復性，以便查閱。MALDI及其他成像技術則 需維持樣品空間構型35。ICP-MS需要排除受外部環(huán)境污染的可能36,所 以對樣品清潔度要求極高。2峋床實驗室開展MS檢測所面臨的挑戰(zhàn)2.1檢測項目（laboratory developedtest, LDT）標準化的不LDT指由臨床實驗室自行開發(fā)的檢測項目。許多臨床實驗室開展LDT檢測的 方法相似，但仍缺乏標準化的基礎。盡管供應商正在著手開發(fā)囊括所有針對 特定待測物檢測所需的試劑、柱以及包括分析軟件在內的試劑盒，但大部 分臨床實驗室對流動相、校準措施、質控措施以其他檢測所需組件仍采用自 行研發(fā)的方式。雖然在監(jiān)管、標準化及室間比對等方面已做了一些努

23、力，但 不同臨床實驗室間的檢測結果仍存在差異。2.2缺少合適的內標經(jīng)同位素標記的“重標準品已經(jīng)十分普遍38,其與待測物化學性質完全 相同，但特定元素被較重的同位素所代替，如2H、13C、15N與18O等。被 替代的元素數(shù)目各異，但待測物分子質量的增加要求其可與標準品易于區(qū)分, 所以有必要為每個待測物都設立特定標記內標，但在檢測多個待測物或仍缺 乏標記物時，可考慮采用替代標準品。這種情況下，標準品的化學性質應盡可 能與待測物接近，由于待測物洗出時存在干擾物質會減弱MS信號，采用同 位素標記標準品可部分補償這類離子抑制效應39。ESI最易受到離子抑制的影響,APCI與APPI則較少受離子抑制影響。

24、如利用 色譜分辨率自無活性的異構體表睪酮中分離出睪酮是較為困難的40,因為 兩者質量相同且質量譜非常接近，準確定量要求一定的色譜分辨率。同樣，隨 著對不同形式維生素D檢測需求的日益凸顯41,色譜分離需進一步努力提 高分辨率。當被測物質量不同時可不采用色譜分離，色譜設備供應商已開始 通過柱化學提高分辨率，但需對儀器進行更換，成本較高。2.3 LC 與 GC 分5所需的時間 為確保GC分析的熱穩(wěn)定性，特別是需要進行衍生化處理時，會延長樣品制備 的時間。2.4樣品制備過程無法實現(xiàn)自動化樣品制備需基于樣品類型、待測物、分析方法、已有設備、操作人員技術水 平、各批次樣品數(shù)量、樣品制備與儀器（柱）污染間的

25、成本/時間平衡，因此 關于何為最佳樣品制備方法的意見尚未統(tǒng)一。血液、血漿與血清被視為 最復雜的樣品基質，需要最煩瑣的制備處理，常需要多次蛋白沉淀與提取，而 其他液體樣品制備則較簡單，可能僅需“稀釋后直接進樣即可。穩(wěn)定、易行 的樣品制備方法是實現(xiàn)穩(wěn)定可重復的定量分析的關鍵之一。自動化樣品制備 雖然備受期待，其在高通量檢測中的前景最為開闊，但前期開發(fā)耗時長且設 備耗材費用高昂。2.5實驗室信息系統(tǒng)的限制處理帶有批次樣品結果的電子數(shù)據(jù)表并進行手工輸入是數(shù)據(jù)處理的限速步驟, 即便數(shù)據(jù)分析是自動化的，但仍需人工進行核對，包括對檢測適應癥、校準和 質控數(shù)據(jù)的回顧以及人工核對臨床樣品峰值。2.6專業(yè)人員的短缺操作者是結果重復性及實驗室穩(wěn)定運行的關鍵。目前，美國的許多臨床實驗 室都存在專業(yè)人員短缺的問題。臨床化學MS實驗室對人員技術水平的要求 高于自動化實驗室，需同時具備手工樣品制備、色譜及儀器日常維護能力。美國臨床化學學會(American Association for Clinical Chemistry, AACC) 質譜與分離分委會(Mass Spectrometry and Separation Sciences Division, MS3)等組織正努力在