臨床實驗室質(zhì)譜檢測原理介紹

1、臨床實驗室質(zhì)譜檢測原理簡介臨床實驗室質(zhì)譜(mass spectrometry,MS )技術(shù)在臨床實驗室中的應(yīng)用隨著MS分析儀的創(chuàng)新不斷拓展。最早的MS分析儀采用扇形電場及磁場實現(xiàn) 質(zhì)量分離，體積大、價格貴。隨著四極桿MS分析儀與色譜分離、第1代氣 相色譜(gas chromatography, GC)及液相色譜(liquid chromatography, LC)技術(shù)的聯(lián)用，大大提升了 MS技術(shù)的實用性。三重四極桿等多重MS技 術(shù)的聯(lián)用與LC分離技術(shù)令檢測向高敏、可重復(fù)、定量方向發(fā)展 這是目前臨 床實驗室開展MS檢測的基礎(chǔ)1。隨著MS分析儀的不斷發(fā)展及軌道阱(Orbitrap)MS分析儀的誕生

2、,LC-MS的聯(lián)用更是如虎添翼。采用GC/MS對類固醇2 及有機酸3進行檢測是MS技術(shù)最先在臨床實驗室 應(yīng)用的項目。繼串聯(lián)MS檢測?；鈮A診斷新生兒遺傳代謝病(inborn error of metabolism, IEM)后，其在臨床檢測中的應(yīng)用開始加速4o LC-MS聯(lián)用 尤其是與串聯(lián)四極桿MS聯(lián)用時，能實現(xiàn)對小分子藥物及其代謝產(chǎn)物的量化 檢測，促進了該領(lǐng)域儀器研發(fā)的進步5。治療藥物監(jiān)測與毒理學(xué)的迅速發(fā)展 在提升儀器靈敏度及實用性的同時，進一步擴大了 MS技術(shù)的應(yīng)用范圍6。1儀器1.1 MS分析儀類型MS分析儀可對單個分子或分子片段進行質(zhì)量分析，要求被分析對象帶電荷 并呈氣相，一般由緊密相

3、連的離子源、質(zhì)量分析器及檢測器3個部分組成。 離子源外接樣品引入系統(tǒng)，是離子生成的部位；多數(shù)MS分析儀的質(zhì)量分析 器根據(jù)離子質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio, m/z)區(qū)分離子；檢測器將離子 分別轉(zhuǎn)換成信號并傳入儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)控制整個儀器。MS技術(shù)具有較高的特異性，尤其在與可重復(fù)色譜分離技術(shù)聯(lián)用時，其檢測結(jié) 果可作為許多臨床檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)。也就是說，該技術(shù)可作為其他特定分子 濃度檢測手段的校準(zhǔn)方法。僅當(dāng)某方法被作為參考方法且檢測嚴(yán)格按照書面 程序進行時，可將液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem-mass spectrome

4、try, LC-MS/MS)作為金標(biāo)準(zhǔn)。但由于 MS 分析儀系統(tǒng)復(fù)雜、維持其精密度以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果亦具有一定難度,MS技術(shù) 常被視作“無其他方法可用時的最佳技術(shù)。MS分析儀根據(jù)m/z離子質(zhì)量(相對原子質(zhì)量)！電荷數(shù)分析被測物的質(zhì) 量。例如,25-羥基維生素D3的相對原子質(zhì)量為400,當(dāng)加入1個質(zhì)子 (400+1 )個質(zhì)子而帶單電荷時，可在m/ z為401處被檢測到；當(dāng)加入2 個質(zhì)子而帶雙電荷時(400+2 )個質(zhì)子402/2 = 201,可在m/z為201處 被檢測到。通常以m/z衡量準(zhǔn)確度，檢測越準(zhǔn)確則分子式鑒定能力越強。仍 以25-羥基維生素D3為例，其分子式為C27H44O2,分子離子經(jīng)

5、質(zhì)子化后的 相對原子質(zhì)量為401 (加入1個質(zhì)子形成C27H45O2 ),其精確質(zhì)量保留至 5位小數(shù)，為401.341 97。盡管經(jīng)質(zhì)子化的C27H45O2(25-羥基維生素D3, m/z 為 401.341 97 )與 C28H49O (菜油甾醇,m/z 為 401.370 52 )之間的質(zhì)量差異僅為0.028 55,但MS技術(shù)仍可通過m/z精確區(qū)分兩者。檢測誤差 決定了質(zhì)量檢測結(jié)果所對應(yīng)的潛在分子式的數(shù)量。高分辨質(zhì)譜儀(high resolution mass spectrometer, HRMS)能精確離子 m/z。整體準(zhǔn)確性及有效位數(shù)層面的質(zhì)量檢測能力是區(qū)分不同類型MS分析儀的標(biāo) 準(zhǔn)之

6、一。為提升整體準(zhǔn)確性,MS分析儀常采用四極桿作為質(zhì)量過濾器。四極 桿由4根桿組成，以相對的2根桿為1組，通過在2組桿上施加相抵消的直 流電高頻電壓來實現(xiàn)質(zhì)量過濾。許多MS分析儀都可提供準(zhǔn)確的質(zhì)量信息，如 檢測加速離子飛行時間的飛行時間(time of flight, TOF)MS分析儀7, 8, 檢測捕獲離子振蕩頻率的分析儀利用磁場捕獲離子的傅里葉變換質(zhì)譜 分析儀(Fourier transform mass spectrometer, FTMS)與通過經(jīng)典吸引 平衡離子慣性進行捕獲的軌道阱MS分析儀9, 10, 11。多重MS技術(shù)的聯(lián)用令MS分析儀能夠在離子水平上同時進行多項臨床實驗。 由3

7、個緊密聯(lián)系的四極桿分析儀組成的三重四極桿較為常用，其常見的工作 模式見圖1 12。最簡單的模式是全掃描，在質(zhì)量分析器設(shè)定的掃描范圍內(nèi)采 集生成的全部離子的信號,Q1與Q3同時進行掃描,Q2設(shè)置為所有離子可通 過、不含碰撞氣體，見圖1(a);產(chǎn)物離子掃描可對不同質(zhì)量的分子進行定 量檢測,Q1設(shè)置為僅特定m/z的離子可通過,Q2中充入碰撞氣體令離子碎 片化,Q3對片段產(chǎn)物進行掃描，見圖1(b);母離子掃描可用于確定一類待 測物中的所有母離子，識別共同碎片并觀察產(chǎn)生該碎片的所有母離子，由Q1 進行掃描，在Q2中通過碰撞氣體使離子碎片化,Q3僅識別特定m/z的離子, 該模式可檢測單個樣品中所有糖基化類

8、型，見圖1(c);與母離子掃描相近 的是中性丟失掃描，該模式對Q1與Q3同時進行掃描，將兩者質(zhì)量抵消偏移, Q2中充入碰撞氣體進行離子片段化處理，可通過觀察m/ z為1（相當(dāng)于水） 處的中性丟失情況來識別所有含羥基的離子，見圖1（d）;選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected reaction monitoring, SRM）為一種三重四極桿分析儀常用的模 式，可用于定量分析,Q1與Q3用于質(zhì)量分析,Q2通過碰撞氣體進行碎片化 反應(yīng)，見圖1（e）。SRM進一步升級即為多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring, MRM）, MRM以SRM為基礎(chǔ)，利用數(shù)據(jù)控制系統(tǒng)循序選擇多 重

9、反應(yīng)類別。當(dāng)MS分析儀連接色譜分離入口時，該模式尤顯重要。多重母 子離子對即母離子與碎片離子的組合，可在特定時間內(nèi)對色譜洗脫出的特定 待測物進行監(jiān)測。如采用化學(xué)性質(zhì)與待測物相同的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品，則標(biāo) 準(zhǔn)品與待測物的母子離子對同樣可通過MRM進行監(jiān)測。各母子離子對的觀 察時間短且與色譜層析圖譜峰寬相關(guān)，可準(zhǔn)確測量峰面積并計算待測物濃 度。SRM與MRM的特異性大幅提升了試驗信噪比，提高了靈敏度。串聯(lián)四極桿可與精密質(zhì)量儀聯(lián)用，較常見的包括Qq-TOF、Qq-FTMS與 Qq-OrbitrapQ代表掃描四極桿,q代表碰撞（碎片）四極桿。這類儀器可 運行上述所有模式，其檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。1.2離子化

10、MS分析均以離子為基礎(chǔ)，故待測物經(jīng)MS分析儀檢測前需進行離子化，是 MS檢測的基本操作。MS分析儀采用過各類離子源，不斷推陳出新，就像許多MS分析儀曾風(fēng)靡一時但如今不再使用一樣。 目前，臨床實驗室MS檢測常用的是LC技術(shù),LC-MS檢測最常涉及的電離方 式有3種：電噴霧電離（electrospray ionization, ESI）、大氣壓化學(xué)電離（atmospheric-pressure chemical ionization, APCI）及大氣壓光電離（atmospheric-pressure photoionization, APPI）。（ 1）ESI 最為常用，盡 管工作機制尚未完全明

11、確，但重要的是ESI過程始于對預(yù)制離子液的霧化 13。液滴隨著溶劑分子的“揮發(fā)而不斷收縮，直至庫侖爆炸令其碎片化。 該過程持續(xù)至溶劑完全去除，留下帶電離子經(jīng)過錐孔（大小需滿足維持分析 過程中的真空需求）進入MS分析儀。同軸氣流可輔助霧化，附加氣流利于 溶劑蒸發(fā)，兩者均可提高流速。電噴霧常產(chǎn)生多種帶電離子，增加電荷數(shù)量可 提升MS分析儀的有效檢測范圍。（2）APCI采用LC流出物氣流輔助噴射 技術(shù)，通過電暈針放電令溶液分子產(chǎn)生活性成分，使待測物分子質(zhì)子化或去 質(zhì)子化，生成MS分析所需的帶電物質(zhì)。（3）APPI同樣采用氣流輔助霧化，但 通過紫外線光源對待測物直接電離，或?qū)饺雵婌F的助劑分子進行電離

12、從而 使待測物離子化。盡管APPI僅適用于含芳香基團的特定類型待測物，但其信 噪比極佳，故分析靈敏度非常高。這3類離子化技術(shù)均可與其他類型流體色 譜法聯(lián)用。ESI與APCI常產(chǎn)生質(zhì)子化分子離子，通過向待測物添加1個質(zhì)子（H+）來觀察帶正電荷的離子，或通過分子離子去質(zhì)子化（去除H+）來觀 察帶負(fù)電荷的離子。APPI常通過丟失1個電子產(chǎn)生激發(fā)態(tài)陽離子。這3類離 子化技術(shù)均屬于“軟電離技術(shù)，主要產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子，通過檢測待測物中 所有特定m/z的離子來提高其靈敏度。GC是與MS分析儀最早進行聯(lián)用的 色譜技術(shù)14, 15,在臨床實驗室已有較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗，但該技術(shù)如今已不 及LC運用普遍。GC/MS采用

13、電子轟擊（electron impact, EI）電離技術(shù)，優(yōu) 勢在于不同儀器所獲得的結(jié)果重復(fù)性較好，能提供大量信息，可外接數(shù)據(jù)庫 能輔助鑒定化合物。與APCI相似,GC亦可向離子源中加入附加反應(yīng)物，使其 離子化并反應(yīng)生成可與待測物進一步反應(yīng)的物質(zhì)，經(jīng)質(zhì)子化或去質(zhì)子化形成 帶正電荷的陽離子或帶負(fù)電荷的陰離子。這種離子化形式亦稱化學(xué)電離(chemical ionization, CI),可減少化合物碎片質(zhì)量的差異，常用于測定未 知物質(zhì)的相對分子質(zhì)量。并非MS技術(shù)分析的所有樣品都需要進行色譜分析?；|(zhì)輔助激光解吸離子 化技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ion

14、ization, MALDI)常用于蛋 白、多肽、寡核苷酸及細(xì)菌檢測16。將待測物與吸收紫外汨ultraviolet, UV) 的基質(zhì)溶劑混合，點樣于光滑金屬板上，干燥后放入MS源，一旦達(dá)到適宜的 真空狀態(tài)，斑點受脈沖UV激光照射會令少量待測物自樣品中釋出，反應(yīng)生成 預(yù)形成離子或離子作為分析物進入MS分析儀。TOF MS電離呈脈沖性，常 用于檢測。MALDI可用于MS成像研究。另一類已成功運用于固體樣品電離的技術(shù)統(tǒng)稱為解吸電離17。該技術(shù)通過 ESI或APCI電離溶劑后導(dǎo)向固體樣品。電離溶劑與固體反應(yīng)后令待測物解吸 并離子化，隨后導(dǎo)入MS分析儀。該技術(shù)已可用于干血斑(dried blood s

15、pot, DBS)18分析及MS成像。MS分析儀聯(lián)合電感耦合等離子體(inductively coupled plasma, ICP)炬 管可m成ICP-MS,能夠檢測金屬物質(zhì)。該電離法采用高溫(10 000 K)氬氣等離子體氣流分裂樣品并電離。儀器可直接檢測樣品中的金屬物質(zhì)，有 效開展重金屬中毒篩查19或聯(lián)合色譜分析明確待測物類別，提供有關(guān)金屬 物質(zhì)化學(xué)環(huán)境的信息20。目前臨床化學(xué)色譜分析中廣泛采用的電離技術(shù)見 表1。表1臨床化學(xué)色譜分析常用電離技術(shù)的比較恚11球化學(xué)色譜分析常用電建投枷曲名稱色瑁法待測物類別待測物分子質(zhì)量缺點曰GC日版性.可欄脩中辰星誨復(fù)性高與LC不兼容CIGCMB.可鈔G

16、C兼信息弓iLCE：客ESILC, SFG: CE極性中-高與許務(wù)生物樣品兼容受跟于坦離抵匍！APCILC, SFC CE彼性.投性鈕i較低中較 ESltEES晏APPILC, SFC CE含芳杏基團較低中高信噪比只能用于含渣舂皇團物質(zhì)的撿測注:SFC為超臨界流體色譜supercritical fuid ctiromatography ) : CE為毛細(xì)管超派(capiliaryel ectropliores is)拽*號0 呈毋皿1.3樣品導(dǎo)入正如MS檢測采用各類離子源一樣，樣品導(dǎo)入技術(shù)同樣也有許多種。其中一 些基于分離輔助混合物分析，其他則側(cè)重于主體樣品，部分具有成像功能。臨床化學(xué)最常用的

17、2種色譜分析法為LC和GC, SFC、凝膠電泳、CE和凝膠 滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)等較少被采用21。除凝膠電泳外，其他方法均可通過表1中的電離技術(shù)直接與MS分析儀串聯(lián)。 SFC流動相多采用加壓二氧化碳，常用于手性分子分離22。CE同凝膠電泳 一樣利用電場進行分離，但在狹小的毛細(xì)管中進行23。GPC亦稱尺寸排阻 色譜(size-exclusion chromatography, SEC),常用于檢測較大生物分子， 與傳統(tǒng)LC不兼容24。LC技術(shù)正處在儀器根本性的變革中。2004年美國Waters公司推出了超高效液相色譜(ultra-per

18、formance liquid chromatography, UPLC)。該高 效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)系統(tǒng)泵 的最大工作壓力可達(dá)1 000 bar( 15 000 psi),較以往提升了 2倍，令柱化 學(xué)新技術(shù)得以被采用，尤其對于較小粒徑的物質(zhì)，反過來提高了色譜分辨率 并減少了色譜運行時間。如上述，解吸技術(shù)可用于非成像檢測，也可用作二維 或三維樣品成像ICP可直接將樣品導(dǎo)入MS分析儀25,也可通過連接LC 加以實現(xiàn)19。LC-ICP-MS技術(shù)可明確樣品中金屬物質(zhì)的種屬。1.4待測物類型、來源及用戶群體臨床MS檢測

19、樣品的制備根據(jù)MS分析儀的分析類型、待測物、進樣系統(tǒng)及 離子源而不同26, 27, 28, 29, 30。樣品類型與來源對樣品制備及預(yù)期的檢 測結(jié)果影響極大。樣品制備最簡單的方式是“稀釋后直接進樣”,正如其字面 意義，該法采用可溶溶劑對樣品簡單稀釋，常用于尿液檢測31;另一種稍復(fù) 雜的樣品制備技術(shù)是蛋白沉淀，該法將溶劑加入血液樣品，令蛋白凝聚并沉 淀常通過離心加強這一過程，一般無法去除樣品中的基質(zhì)或脂質(zhì)干擾。液- 液萃取是與既往技術(shù)相比具有一定優(yōu)勢的經(jīng)典樣品制備技術(shù)，但難以實現(xiàn)自 動化。固相萃取技術(shù)使用固化吸附劑吸附待測物，可徹底清除樣品中的基質(zhì) 或脂質(zhì)干擾32。固化吸附劑的親和力不同，需根據(jù)

20、樣品及待測物類型進行選 擇，未被吸附的干擾物經(jīng)洗脫后，要采用強溶劑再次洗脫待測物。成功制備樣 品的關(guān)鍵在于通過操作達(dá)到所需的樣品清潔度及充分的檢出限(limit ofdetection, LOD ）即可，超出檢測所需的制備操作會增加時間與成本。常用LC-MS/MS樣品制備技術(shù)的比較見表2。表2常用LC-MS/MS樣品制備技術(shù)的比較裹2制HLC-M引M溜盆!掀的岐優(yōu)點樣品話用性稀釋后直接進樣簡單、成技誠、快速清陶期底、m涸剝史樣品券釋鼠液帶m沉淀屏、g誠快速極低選擇性,無法消除基序F擾血液,血漿、血清液-液萃取真有分析物類特異性、瞰大濃盅制垃現(xiàn)自靴禰、血漿、皓簡單、快道（如實現(xiàn)自動化K易于嘛快性

21、眼夜、峽雷白質(zhì)必旨質(zhì)開發(fā).可血清快速如實現(xiàn)自動化）、回屋高、M方法開發(fā)宣雜.耕械本最裔所有種英樣品分析物類雖暗異性.可放大濃度注:各樣品若臨技術(shù)按表中由上至下1IS序建匚醐曾、易用性遂喊貿(mào)綁號莖因現(xiàn)GC-MS分析要注意的是：待測物應(yīng)能夠利用GC熱揮發(fā)進行分離。如待測物 分子不揮發(fā)或受熱降解，則在保證樣品潔凈度的同時，還要進行衍生化處理 令其揮發(fā)33, 34。MALDI及其他未涉及色譜層析分離的技術(shù)采用不同的樣品制備方式。定量 MALDI與LC-MS/MS相似，常采用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)加入已知濃度樣品。在 相同溶劑中溶解樣品與基質(zhì)會帶來結(jié)晶、非必要沉淀等問題。微生物MS檢 測要求樣品制備方式有較高的

22、重復(fù)性，以便查閱。MALDI及其他成像技術(shù)則 需維持樣品空間構(gòu)型35。ICP-MS需要排除受外部環(huán)境污染的可能36,所 以對樣品清潔度要求極高。2峋床實驗室開展MS檢測所面臨的挑戰(zhàn)2.1檢測項目（laboratory developedtest, LDT）標(biāo)準(zhǔn)化的不LDT指由臨床實驗室自行開發(fā)的檢測項目。許多臨床實驗室開展LDT檢測的 方法相似，但仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)。盡管供應(yīng)商正在著手開發(fā)囊括所有針對 特定待測物檢測所需的試劑、柱以及包括分析軟件在內(nèi)的試劑盒，但大部 分臨床實驗室對流動相、校準(zhǔn)措施、質(zhì)控措施以其他檢測所需組件仍采用自 行研發(fā)的方式。雖然在監(jiān)管、標(biāo)準(zhǔn)化及室間比對等方面已做了一些努

23、力，但 不同臨床實驗室間的檢測結(jié)果仍存在差異。2.2缺少合適的內(nèi)標(biāo)經(jīng)同位素標(biāo)記的“重標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)十分普遍38,其與待測物化學(xué)性質(zhì)完全 相同，但特定元素被較重的同位素所代替，如2H、13C、15N與18O等。被 替代的元素數(shù)目各異，但待測物分子質(zhì)量的增加要求其可與標(biāo)準(zhǔn)品易于區(qū)分, 所以有必要為每個待測物都設(shè)立特定標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，但在檢測多個待測物或仍缺 乏標(biāo)記物時，可考慮采用替代標(biāo)準(zhǔn)品。這種情況下，標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)性質(zhì)應(yīng)盡可 能與待測物接近，由于待測物洗出時存在干擾物質(zhì)會減弱MS信號，采用同 位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品可部分補償這類離子抑制效應(yīng)39。ESI最易受到離子抑制的影響,APCI與APPI則較少受離子抑制影響。

24、如利用 色譜分辨率自無活性的異構(gòu)體表睪酮中分離出睪酮是較為困難的40,因為 兩者質(zhì)量相同且質(zhì)量譜非常接近，準(zhǔn)確定量要求一定的色譜分辨率。同樣，隨 著對不同形式維生素D檢測需求的日益凸顯41,色譜分離需進一步努力提 高分辨率。當(dāng)被測物質(zhì)量不同時可不采用色譜分離，色譜設(shè)備供應(yīng)商已開始 通過柱化學(xué)提高分辨率，但需對儀器進行更換，成本較高。2.3 LC 與 GC 分5所需的時間 為確保GC分析的熱穩(wěn)定性，特別是需要進行衍生化處理時，會延長樣品制備 的時間。2.4樣品制備過程無法實現(xiàn)自動化樣品制備需基于樣品類型、待測物、分析方法、已有設(shè)備、操作人員技術(shù)水 平、各批次樣品數(shù)量、樣品制備與儀器（柱）污染間的

25、成本/時間平衡，因此 關(guān)于何為最佳樣品制備方法的意見尚未統(tǒng)一。血液、血漿與血清被視為 最復(fù)雜的樣品基質(zhì)，需要最煩瑣的制備處理，常需要多次蛋白沉淀與提取，而 其他液體樣品制備則較簡單，可能僅需“稀釋后直接進樣即可。穩(wěn)定、易行 的樣品制備方法是實現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)的定量分析的關(guān)鍵之一。自動化樣品制備 雖然備受期待，其在高通量檢測中的前景最為開闊，但前期開發(fā)耗時長且設(shè) 備耗材費用高昂。2.5實驗室信息系統(tǒng)的限制處理帶有批次樣品結(jié)果的電子數(shù)據(jù)表并進行手工輸入是數(shù)據(jù)處理的限速步驟, 即便數(shù)據(jù)分析是自動化的，但仍需人工進行核對，包括對檢測適應(yīng)癥、校準(zhǔn)和 質(zhì)控數(shù)據(jù)的回顧以及人工核對臨床樣品峰值。2.6專業(yè)人員的短缺操作者是結(jié)果重復(fù)性及實驗室穩(wěn)定運行的關(guān)鍵。目前，美國的許多臨床實驗 室都存在專業(yè)人員短缺的問題。臨床化學(xué)MS實驗室對人員技術(shù)水平的要求 高于自動化實驗室，需同時具備手工樣品制備、色譜及儀器日常維護能力。美國臨床化學(xué)學(xué)會(American Association for Clinical Chemistry, AACC) 質(zhì)譜與分離分委會(Mass Spectrometry and Separation Sciences Division, MS3)等組織正努力在