齊魯醫(yī)學(xué)胃潰瘍模型

1、精品醫(yī)學(xué)文檔 精品醫(yī)學(xué)文檔 精品醫(yī)學(xué)文檔 胃潰瘍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞剿? 病因病機(jī)消化性潰瘍是一種常見的消化系統(tǒng)慢性病。中醫(yī)學(xué)屬“胃脘痛”范疇。胃脘痛又稱胃痛，臨床表現(xiàn)以胃脘部經(jīng)常疼痛為主癥，痛時(shí)連及脅背，或兼見惡心、嘔吐、吞酸、嘈雜，大便溏薄或秘結(jié)，甚至吐血、便血等癥【1】。胃、十二指腸潰瘍的病因和發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。目前認(rèn)為胃、十二指腸是一種多病因疾病，各種與發(fā)病有關(guān)的因素如胃酸、胃蛋白酶、感染、遺傳、環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣、神經(jīng)精神因素等均可誘發(fā)潰瘍產(chǎn)生。而胃酸-胃蛋白酶的侵襲作用增強(qiáng)和胃粘膜防護(hù)機(jī)制的削弱是本病發(fā)生的基本原理，任何影響這兩者平衡關(guān)系的因素，都可能是本病發(fā)病及復(fù)發(fā)的原

2、因。其次幽門螺桿菌的感染可引發(fā)胃內(nèi)多種炎性介質(zhì)的釋放，這些炎性介質(zhì)可致胃黏膜的損傷。胃、十二指腸潰瘍?cè)谥嗅t(yī)學(xué)屬于胃痛、胃脘痛、心痛等范疇。中醫(yī)認(rèn)為該病的發(fā)生主要由于情志失調(diào)，傷肝犯胃；飲食不節(jié)或勞倦過度，脾胃虛寒；外感寒邪，內(nèi)客于胃等導(dǎo)致胃失和降、氣機(jī)不利、胃失濡養(yǎng)而發(fā)生胃脘痛。胃脘痛的發(fā)生，其病變臟腑主要在胃，但與肝脾關(guān)系密切，膽腎也與之相關(guān)。若久病人絡(luò)，瘀血阻滯胃絡(luò)，絡(luò)脈損傷，則會(huì)出現(xiàn)吐血、便血等癥。潰瘍模型的種類與方法幽門結(jié)扎型潰瘍、應(yīng)激性潰瘍（水浸法）、胃粘膜損傷性潰瘍（醋酸法）、藥物誘發(fā)型潰瘍。四種潰瘍動(dòng)物模型總的特點(diǎn)是：結(jié)扎法潰瘍?yōu)閳A形、橢圓形、線性，結(jié)扎后隨時(shí)間延長(zhǎng)，潰瘍數(shù)目增加

3、，潰瘍恒定發(fā)生在前胃部，深達(dá)肌層。應(yīng)激法潰瘍數(shù)量多，水溫超過24潰瘍出現(xiàn)少而輕，水浸8h以上開始出現(xiàn)潰瘍，隨時(shí)間延長(zhǎng)潰瘍數(shù)量增加，潰瘍均發(fā)生在腺胃部，潰瘍淺表，均不累及粘膜肌層。醋酸法潰瘍發(fā)生在注射部位，潰瘍部位胃壁增厚，潰瘍數(shù)與注射醋酸部位準(zhǔn)確與否有關(guān)，病理組織學(xué)改變與人類慢性潰瘍近似。藥物誘發(fā)性潰瘍發(fā)生在腺胃部，潰瘍數(shù)量少，體積小而淺表，僅累積粘膜上皮表層，部分深達(dá)粘膜腺體，但不超過粘膜肌層。2.1應(yīng)激性潰瘍模型2.1.1 應(yīng)激性潰瘍?cè)響?yīng)激性潰瘍發(fā)生機(jī)制有復(fù)雜的神經(jīng)一體液因素參與，應(yīng)激性胃潰瘍是先使皮層中樞的興奮和抑制過程失調(diào)，進(jìn)而引起植物神經(jīng)調(diào)節(jié)功能紊亂，導(dǎo)致迷走神經(jīng)張力過高，致使胃肌

4、強(qiáng)力收縮，壓迫肌肉血管，引起繼發(fā)性黏膜血管運(yùn)動(dòng)障礙，導(dǎo)致潰瘍形成。人類由于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷等可產(chǎn)生急性應(yīng)激性潰瘍，精神過度緊張，強(qiáng)烈的情緒激動(dòng)導(dǎo)致潰瘍的發(fā)生或復(fù)發(fā)。與中醫(yī)肝郁型自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂有一定的聯(lián)系。 2.1.2 應(yīng)激性潰瘍方法 選取體重在160180g健康大鼠，禁食自由飲水48h后，將大鼠頭向上束縛于老鼠固定器，以不能自由活動(dòng)為度。隨即將動(dòng)物頭部向上垂直浸泡在溫度相對(duì)恒定(水溫一般20左右)的冷水中，水平面在大鼠劍突部位，20h后取出，用頸椎脫位法處死動(dòng)物，剖腹將胃取出，結(jié)扎賁門、幽門，從腺胃部注入1 甲醛10mL于胃中，并將全胃放入1 甲醛溶液浸泡10 min，沿胃大彎將胃剪開，用

5、自來水輕輕沖洗胃黏膜面，用棉簽拭去腺胃部血絲，然后展開腺胃部，肉眼或放大鏡觀察腺胃部黏膜損傷程度。潰瘍位于腺胃部，表現(xiàn)為點(diǎn)狀出血，并出現(xiàn)線狀或直徑為l-2mm圓形表淺性潰瘍，潰瘍的程度以潰瘍指數(shù)表示，并計(jì)算潰瘍的發(fā)生率。潰瘍發(fā)生率：潰瘍發(fā)生的動(dòng)物數(shù)占試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)的百分比。2.1.3應(yīng)激潰瘍模型評(píng)價(jià)指標(biāo)（以下指標(biāo)對(duì)胃潰瘍模型均適用） 圖像積分法量化潰瘍面積【5-6】：造模成功取胃后，沿胃大彎剪開，將胃壁展平，用數(shù)碼相機(jī)將胃壁拍下，拍攝距離為10 cm用 photoshop60軟件處理圖片，分辨率為72像素英寸，每張圖片設(shè)置為20 cm15 cm(實(shí)物等比圖片為4 cm3 cm)，RGB格式，加網(wǎng)格

6、線(視圖顯示網(wǎng)格)，然后對(duì)潰瘍所占的格數(shù)進(jìn)行積分。占一格者或大于等于12格記為1分，小于12格者記為05分，總計(jì)后作為積分同樣對(duì)胃總面積進(jìn)行積分，將潰瘍面積的積分與胃總面積的積分的比值代表潰瘍面積比。全胃的潰瘍面積比為該鼠的潰瘍指數(shù),根據(jù)潰瘍指數(shù)進(jìn)一步計(jì)算潰瘍抑制百分率：潰瘍抑制率百分率=(對(duì)照組潰瘍指數(shù)-給藥組潰瘍指數(shù))/對(duì)照組潰瘍指數(shù)100%。圖像積分法是統(tǒng)計(jì)潰瘍面積胃總面積的比值，可以消除胃面積大小不均造成的誤差，使統(tǒng)計(jì)結(jié)果更精確，量化 并且，這種方法簡(jiǎn)單方便， 圖像積分法是利用大眾性的photoshop軟件處理圖像，實(shí)驗(yàn)室能達(dá)到此方法所需的條件及技術(shù)要求。 胃黏膜NOS測(cè)定【8-9】：

7、內(nèi)源性一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種重要的氣體信使分子，在胃腸道各種生理及病理活動(dòng)過程中起重要作用。NO血管內(nèi)皮舒張因子能改善胃黏膜的微循環(huán)血流量，維持和加強(qiáng)胃黏膜屏障，抑制胃腸運(yùn)動(dòng)及調(diào)節(jié)胃酸分泌，從而有效地保護(hù)胃黏膜。NOS是NO合成過程中的關(guān)鍵酶，在應(yīng)激狀態(tài)下，大鼠胃黏膜氧自由基不斷蓄積，并發(fā)生微循環(huán)障礙導(dǎo)致胃黏膜損傷，而NO的產(chǎn)生即可減輕胃黏膜的損傷以阻礙胃潰瘍的發(fā)生與發(fā)展?？?jié)兯幬飳?duì)胃黏膜NOS的產(chǎn)生皆具有一定的調(diào)節(jié)作用，使其增加并維持在一個(gè)較高的水平，起到保護(hù)胃黏膜的效果，因此NOS的測(cè)定在抗?jié)兯幬镅芯恐杏幸欢ㄖ笇?dǎo)意義。按南京建成生物工程研究所提供的說明書進(jìn)行操

8、作。即：取大鼠胃黏膜組織01 g加9倍的生理鹽水09 mL制備成10的組織勻漿，3000 rmin，離心10 min，取上清50 L測(cè)NOS活力，另取50 L測(cè)蛋白含量。將測(cè)量值代人下述公式得出總NOS活力值?？侼OS活力=總NOS測(cè)定管A值空白管A值呈色物納摩爾消光系數(shù)反應(yīng)液總積取樣量1比色光徑反應(yīng)時(shí)間蛋白含量脾指數(shù)的測(cè)定【8】：麻醉處死后取脾稱重，脾指數(shù)()=脾臟質(zhì)量體質(zhì)量X 100 。2.1.4 注意事項(xiàng)（1）動(dòng)物體重大小應(yīng)基本一致，籠底不能積留糞便，一面動(dòng)物自食。（2）潰瘍程度與應(yīng)激強(qiáng)度密切相關(guān)，包括應(yīng)激時(shí)間、水溫、水浸部位的高度因素，應(yīng)嚴(yán)格控制，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）注意應(yīng)激時(shí)捆綁

9、動(dòng)物的松緊度，避免動(dòng)物溺水死亡或來回移動(dòng)影響水浸部位高度。（4）雌性大鼠性烈，較易形成潰瘍，實(shí)驗(yàn)時(shí)注意選用雌鼠。 （5）實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物需單籠飼養(yǎng)。2.1.5 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論 在應(yīng)激實(shí)驗(yàn)摸索中，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，做應(yīng)激胃潰瘍模型應(yīng)選用雌性體重160180g健康大鼠為宜，應(yīng)激過程中控制水溫在230.5，大鼠浸泡20h后取出，在該條件下做應(yīng)急胃潰瘍實(shí)驗(yàn)，較易成功造模，重復(fù)性好，且模型肉眼可見潰瘍較明顯。2.2 幽門結(jié)扎型潰瘍2.2 .1 幽門結(jié)扎型潰瘍?cè)斫Y(jié)扎大鼠幽門造成胃液在胃中滯留，致潰瘍因素增強(qiáng)，胃壁防御能力減弱，導(dǎo)致潰瘍形成。2.2 .2 幽門結(jié)扎型潰瘍方法 選取體重在180200g健康大鼠，禁食

10、自由飲水72h后，用水合氯醛麻醉,打開腹腔,用縫合線結(jié)扎幽門十二指腸結(jié)合部。結(jié)扎時(shí)小心避開血管，縫合腹壁。術(shù)后18 h結(jié)扎賁門取出全胃，將胃浸入1%甲醛溶液中, 10 min后,在胃大彎處剪一小口收集胃液。然后沿胃大彎將胃剪開，用自來水輕輕沖洗胃黏膜面，將胃平鋪于白紙上，觀察潰瘍發(fā)生情況。2.2.3 幽門結(jié)扎型潰瘍?cè)u(píng)價(jià) pH值的測(cè)定:把取出的胃體沿胃大彎剪一小口,將胃液傾倒于刻度離心管中,用精密pH試紙測(cè)胃液的pH值,記錄。 胃液量的測(cè)定:將上述胃液以3000r/min的速度離心10min后,用10ml注射器抽取離心管中的上清液,記錄胃液總量,將胃液注入試管中。 胃酸的測(cè)定：將清晰胃液各取1m

11、l分別置于小燒杯中，加入酚紅指示劑2滴，用滴定管用0.01mol/LNaOH滴定直至溶液變紅不退為止，即為胃酸的總酸度（mmol/L）。 胃蛋白酶的測(cè)定：采用麥特氏毛細(xì)玻管測(cè)定法。將內(nèi)徑12mm粗細(xì)均勻的毛細(xì)玻管裁成10cm長(zhǎng)，洗凈烤干待用。用雞蛋一個(gè)，取其蛋清充分打勻后用濾布過濾，將備用毛細(xì)玻管利用虹吸作用，灌滿蛋清（注意管內(nèi)無氣泡）。然后放在85熱水中使蛋白凝固，貯冰箱中備用。試驗(yàn)時(shí)取胃液1ml放入50ml的三角燒瓶中，加0.05mol/L鹽酸溶液15ml搖勻，放進(jìn)蛋白管二根。塞好瓶口，在37恒溫孵育24h，取出蛋白管，用尺測(cè)量蛋白管兩端透明部分的長(zhǎng)度(mm),以四端之值求其平均值。胃蛋白

12、酶活性單位=平均值216；胃蛋白酶排出量（活性單位/h）=胃蛋白酶活性單位每小時(shí)胃液量。2.2.4 注意事項(xiàng)（1）動(dòng)物要嚴(yán)格禁食72h,以使胃內(nèi)完全排空，否則食物殘?jiān)鼤?huì)影響胃分泌。（2）手術(shù)幽門結(jié)扎時(shí)，須小心避開血管，否則因胃腸血液循環(huán)受阻而影響胃分泌。勿用器械鉗夾胃壁，因器械對(duì)胃的刺激處，易形成潰瘍，干擾試驗(yàn)。（3）實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物需單籠飼養(yǎng)。參考文獻(xiàn)：1 王國(guó)慶，淺談胃脘痛的辯證與治療J.中醫(yī)研究，2009,22（6）：53-54.2 劉良，王建華，邵庭蔭等，大鼠束縛水浸應(yīng)激性胃潰瘍模型的實(shí)驗(yàn)控制J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1988,4(4):246-248.3 邢建峰，董亞琳，王秉文等，沙棘果肉油

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