3蔗糖酶蛋白含量測定及活力測定

1、專業(yè)：姓名：孫程珂學(xué)號：3150100531日期：地點(diǎn)：溯y乂學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）指導(dǎo)老師：楊勁樹成績:同組學(xué)生姓名：二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笕?、?shí)驗(yàn)材料和主要儀器五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)討論和心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；2、掌握分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確測定未知樣品的蛋白質(zhì)含量；3、掌握分光光度計(jì)的使用方法。4、掌握酶活力測定的基本原理和方法；5、學(xué)習(xí)酶的比活力的計(jì)算。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理Folin-酚測定法是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，F(xiàn)olin-酚試劑是由甲、乙兩種試

2、劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基（酚基）和色氨酸還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（乙試劑）產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物），其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。可用500nm波長比色測定，適于測定蛋白質(zhì)含量0.050.5g/L.優(yōu)點(diǎn)：簡單、迅速、靈敏度高；反應(yīng)較穩(wěn)定。缺點(diǎn)：該反應(yīng)受多種因素的干擾。蔗糖酶（0-D-咲喃型果糖苷-果糖水解酶EC321.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2糖苷鍵裂解，將蔗

3、糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，例如：納爾遜一索模吉（Nelson-Smogyi）試劑比色法，斐林試劑法等。本實(shí)驗(yàn)采用3.5二硝基水楊酸法測定還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此可利用分光光度計(jì)在500nm進(jìn)行比色測定，求得樣品中的含糖量。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。蔗糖酶活力單位（u）:蔗糖酶在室溫（50C）,pH4.5的條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1pmol葡萄糖所需的酶量（ml）。蔗糖酶比

4、活力的計(jì)算：酶的比活力一一為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示。酶的比活力在酶學(xué)研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。比活力一一酶的總活力單位數(shù)除以總蛋白mg數(shù)，即每mg蛋白所含有的酶活力單位數(shù)。比活力=活力單位/mg蛋白P.2實(shí)驗(yàn)名稱：姓名：學(xué)號:三、實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器1、實(shí)驗(yàn)材料蔗糖酶提取的各步分離純化樣品I、II、III、IV?？筛鶕?jù)樣品溶液的蛋白質(zhì)含量高低作適當(dāng)?shù)南♂尅?、實(shí)驗(yàn)試劑（1）Folin-酚測定法：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.5

5、g/L牛血清白蛋白Folin-酚試劑（甲試劑、乙試劑）（2）3,5-二硝基水楊酸比色法：lg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（葡萄糖相對分子量198.17）5%蔗糖溶液0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.53,5二硝基水楊酸試劑（DNS）3、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（1）恒溫水?。?0C、100C）；（2）可見光分光光度計(jì)、1cm玻璃比色皿；（3）試管、試管架；（4）移液管；（5）微量移液器：200p1、1000pl四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1、制備Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線試管號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg）00.10.20.30.40.50.5g/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）00.20.40.60.81蒸餡水（ml）

6、10.80.60.40.20Folin-酚試劑甲(ml)555555混勻，在室溫（25C）下靜置10minFolin-酚試劑乙(ml)0.50.50.50.50.50.5混勻（加一管混一管），在室溫（25C）下靜置20min500nm00.1620.3300.4670.5800.695以光吸收值（A500）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、各步分離純化的樣品蛋白含量測定表2（4倍稀釋：樣品0.25ml+蒸餾水0.75ml）樣品空白1（4倍稀釋）口（4倍稀釋）in（4倍稀釋）IV（原閻編號12345678910111213樣品液V（ml）0.00.050.20.5

7、0.050.20.50.050.20.50.050.20.5水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5Folin酚甲試劑(ml)5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫（25P）放置lOminFolin酚乙試劑(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5混勻（加一管混一管）,室溫（25P）放置20mineooim00.1901.0331.6700.2850.9441.5240.1010.5701.1390.0460.2660.554P.3實(shí)驗(yàn)名稱：姓名

8、：學(xué)號:根據(jù)測得的光吸收值（A500），查蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進(jìn)行樣品I、II、III、IV溶液的最終蔗糖酶蛋白含量的計(jì)算。3、制備3,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線1234567葡萄糖含量（umol）01.01.52.02.53.03.5lg/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.20.30.40.50.60.7H2O(ml)21.81.71.61.51.41.33.5-二硝基水楊酸（ml）1.01.01.01.01.01.01.0將各管溶液混勻后，在1009恒溫水浴加熱5min,取出立即用冷水冷卻至室溫蒸餡水（ml）7771771將各管溶液混勻A520mn00.1890.2910.563

9、0.7040.9391.068以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，A520值為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖濃度一吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、各樣品蔗糖酶的酶活力測定表4（200倍稀釋：4倍稀釋液0.02ml+蒸餾水0.98ml）樣品空白I（200倍稀釋）n（200倍稀釋）111（2佛稀釋）IV（50倍稀釋）編號123456789101112130.2mol/L乙酸緩沖液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5蒸餡水（ml）1.00.950.80.50.950.80-50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液（ml）0.00.050.20.50.050.20.50.

10、050.20.50.050.20.55%蔗糖溶液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保溫時(shí)間立即混勻后，50X：保溫lOmin3.5二硝基水楊酸翩（ml）1111111111111在100*C恒溫水浴中加熱5min蒸餡水1777717777777混勻52000.0380.2140.6550.0450.1170.6220.0580.2690.9970.0550.3961.065根據(jù)測得的光吸收值（A520），查標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶活力，再進(jìn)行樣品I、II、III、V溶液的最終蔗糖酶活力的計(jì)算。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1.數(shù)據(jù)：已記錄在實(shí)驗(yàn)步驟的表格當(dāng)中

11、2.處理：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線v=1.3903x+0.0248葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲錢V=1.6218x-0.0893Rz=0.9923Ri=0.9732實(shí)驗(yàn)名稱：姓名：學(xué)號:六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析1.經(jīng)計(jì)算，可得總表如下體積(ml)蛋白濃度(mg/ml)總蛋白(mg)活力(u/ml)總活力u比活力u/mg樣品I352.95103.2561.35214720.79樣品II303.2296.651.02153115.85樣品III9.59.7192.24588.5840.79.114樣品V5.50.8054.427598.04539.2121.82分析：樣品IV的比活力在數(shù)值上比其他樣品大太多，原因可能是柱層析時(shí)收集蛋白液的時(shí)機(jī)沒有把握好，使得蛋白含量較少；另一方面，可能是在測酶活力時(shí)稀釋的時(shí)候所用的酶量過多，導(dǎo)致稀釋造成的誤差太大；當(dāng)然，體積測量、分光光度測量的過程中均存在誤差。由數(shù)據(jù)還是可以看出蛋白酶在一系列的純化操作中不斷的更純，雜蛋白被逐步的去除。七、實(shí)驗(yàn)討論和心得1加入Folin-酚試劑后，要迅速混勻(加一管混勻一管)，使還原反應(yīng)產(chǎn)生在磷鉬酸-磷鎢酸被破壞之