南藥高良姜基因組DNA提取方法的研究

1、南藥高良姜基因組DNA提取要領(lǐng)的研究龐啟華，嚴(yán)萍，趙翾，趙樹進(jìn)【摘要】目的提取高質(zhì)量的高良姜基因組DNA，用于藥材分子斷定、分子體系分類和分子進(jìn)化等卑劣分子生物學(xué)研究。要領(lǐng)在TAB改進(jìn)法底子上，接納4個(gè)方案提取DNA。結(jié)果用改進(jìn)TAB法方案4提取的基因組DNA的D260/D280比值在1.82.0之間，產(chǎn)率為0.541.049g/g枯燥葉片?；蚪MDNA能被限定性內(nèi)切酶ER和se完全酶切，經(jīng)AFLP闡發(fā)，得到了條帶清楚的DNA指紋圖譜。結(jié)論用改進(jìn)TAB法方案4提取的基因組DNA純度高，切合分子生物學(xué)研究要求?！娟P(guān)鍵詞】高良姜；基因組DNA；提取Keyrds:AlpiniaffiinaruHan

2、e;GeniDNA;Extratin高良姜AlpiniaffiinaruHane是姜科山姜屬植物，在中國(guó)重要漫衍于廣東、海南、臺(tái)灣、云南和廣西(后兩省為引種)。高良姜枯燥的根莖是知名的十大南藥之一，有一千多年藥用汗青，據(jù)?中國(guó)藥典?紀(jì)錄，高良姜味辛、性熱，歸脾、胃經(jīng)，具有溫胃散寒、行氣止痛和消食的成果1，研究表白高良姜另有普及的藥理作用2，在香料消費(fèi)和水果保鮮上也有應(yīng)用3，4。恒久的采挖和生態(tài)情況粉碎，導(dǎo)致高良姜野生資源驟減，如今重要通過無性生殖的方法舉行人工種植。比年來，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)高良姜需求增大，國(guó)產(chǎn)高良姜遠(yuǎn)銷中東和西歐，代價(jià)呈上升趨勢(shì)，長(zhǎng)處的驅(qū)動(dòng)導(dǎo)致了殽雜品和偽品的出現(xiàn)，影響了治療結(jié)果，擾

3、亂了市場(chǎng)，對(duì)高良姜的出口造成了負(fù)面影響。通過DNA分子標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟技能創(chuàng)立高良姜的DNA指紋圖譜，以及舉行高良姜的分子體系分類、分子進(jìn)化和遺傳多樣性研究，可以為高良姜的藥材的分子斷定和質(zhì)量操縱，以及高良姜種質(zhì)資源庇護(hù)和開拓提供科學(xué)根據(jù)，而提取高質(zhì)量的高良姜基因組DNA是舉行下一步研究的條件條件。植物含有富厚的次生代謝物，這些化合物的存在滋擾了基因組DNA的提取，差異的植物含有的次生代謝物不一樣，基因組DNA的提取要擁有所差異，重要有TAB法和SDS法兩種根本要領(lǐng)，并在此底子上舉行改進(jìn)以得當(dāng)差異的植物57。本研究按照通例的TAB法8舉行改進(jìn)，比力了4個(gè)方案提取高良姜基因組DNA的結(jié)果，此中，方案

4、4提取結(jié)果較好，DNA純度和產(chǎn)率較高，可以用于卑劣的分子生物學(xué)研究。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1試劑和溶液TAB，PVP-40，Tris為Genvie分裝，-巰基乙醇、RNAseA為siga分裝，EDTA、氯仿、異戊醇、異丙醇和無水乙醇為國(guó)產(chǎn)闡發(fā)純，ER和se為NEB產(chǎn)物，Hindarker和DL2000arker為Takara產(chǎn)物。洗濯緩沖液：200l/LTris-Hl(pH8.0)；50l/LEDTA；250l/LNal；2%PVP-40(/V)提取緩沖液A：2%TAB(/v)；100l/LTris-HlpH8.0；20l/LEDTApH8.0；1.4l/LNal；2%PVP-40(/V)提取緩沖液

5、B：2%TAB(/v)；100l/LTris-HlpH8.0；20l/LEDTApH8.0；4l/LNal；2%PVP-40(/V)提取緩沖液：3%TAB(/v)；100l/LTris-HlpH8.0；20l/LEDTApH8.0；1.4l/LNal；2%PVP-40(/V)10%TAB溶液：10%TAB；0.7l/LNalTE緩沖液：10l/LTrisHlpH8.0；1l/LEDTApH8.0以上溶液都經(jīng)高壓滅菌，備用。1.2儀器115K高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(Siga)，D/U530DNA/PrtEinAnalyzer(Bekan)，del200/210PerSupply(BiRad)，DYP

6、31D型程度電泳槽(北京市六一儀器廠)，hite/UVTransilluinatr凝膠成像儀。1.3質(zhì)料試驗(yàn)質(zhì)料采自廣東的廣州、深圳和徐聞、海南萬寧、廣西南寧、云南西雙版納等地，顛末中國(guó)科學(xué)院華南植物研究所邢福武傳授斷定為植物高良姜A.ffiinaruHane。采摘高良姜頂端嫩葉，剪為約2長(zhǎng)的小段，放入裝有枯燥硅膠的密封袋中舉行快速枯燥，硅膠與葉子的體積比約莫為101，硅膠吸水變色時(shí)要調(diào)換硅膠，枯燥葉片保存在密封的塑料袋中置于-20保存。1.4提取DNA的步調(diào)1.5提取DNA的方案1.6DNA濃度、純度的測(cè)定DNA的濃度ng/lD26050ng/l稀釋倍數(shù)DNA產(chǎn)率DNA濃度ng/lDNA原液

7、體積l/干葉重量/g2結(jié)果與討論從植物構(gòu)造中提取DNA必需撤除卵白質(zhì)、RNA、多糖、多酚等雜質(zhì)，尤其是多糖和多酚，它們的存在會(huì)嚴(yán)峻按捺限定性內(nèi)切酶和TaqDNA聚合酶的活性9，10，影響后續(xù)的研究。DNA的純度可以從D260/D280比值和D260/D230比值來斷定。DNA在260n處有汲取峰，而卵白質(zhì)在280n處有汲取峰，理論上D260/D2801.8時(shí)表現(xiàn)DNA純潔，D260/D2801.8時(shí)表現(xiàn)有卵白質(zhì)污染，D260/D2801.8時(shí)表現(xiàn)有RNA污染，在230n處有汲取表現(xiàn)有多酚和色素污染11。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果來看，方案1提取的DNA主亮帶清楚且沒有顯著拖尾征象，但是加樣孔較亮圖1

8、A，說明DNA較完備，但是多糖沒有去除干凈。方案2和方案3提取的DNA，未見有DNA亮帶圖1B，說明DNA含量很低，與分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果同等。方案4提取的DNA主亮帶清楚，沒有拖尾，加樣孔比力干凈圖1，外貌DNA完備且純度高。用方案4提取的基因組DNA經(jīng)ER和se酶切，在1.6%脂糖糖凝膠上條帶呈勻稱的彌散狀條帶圖2，說明DNA被完全酶切，做AFLP闡發(fā)可以或許得到清楚的多態(tài)性條帶圖3，以上結(jié)果進(jìn)一步表白，用方案4提取的DNA純度較高，切合分子生物學(xué)研究的要求。我們用方案4提取了采自廣東、海南、廣西、云南等地170多份高良姜的基因組DNA，都獲得了較好的結(jié)果，D260/D280比值在1.82.

9、0的范疇內(nèi)，D260/D230比值大部門大于1.7，小部門D260/D230比值在1.7以下，大概是由于田野網(wǎng)羅時(shí)，用枯燥硅膠處置懲罰樣品時(shí)沒有實(shí)時(shí)調(diào)換，導(dǎo)致葉片褐變，提取DNA的時(shí)間很難完全撤除褐變的色素。全部提取的基因組DNA都可以被限定性內(nèi)切酶完全酶切和舉行PR反響，因此以為基因組DNA的純度都切合研究要求。3結(jié)論提取高良姜基因組DNA時(shí)應(yīng)該留意以下事項(xiàng)：幼嫩的葉子DNA含量高而次生代謝物含量低，因此試驗(yàn)質(zhì)料只管采幼嫩的葉子。用枯燥硅膠處置懲罰葉片時(shí)應(yīng)實(shí)時(shí)調(diào)換變色的硅膠，不然葉片輕易褐變，影響以后DNA的提取和純化。用液氮研磨葉片時(shí)要徹底，研磨完要敏捷轉(zhuǎn)移到離心管中并置碎冰上保持低溫。研

10、磨徹底是為了得到較高的DNA產(chǎn)率，敏捷轉(zhuǎn)移是防范樣品長(zhǎng)時(shí)間與氣氛打仗導(dǎo)致多酚物質(zhì)被氧化，保持低溫是為了按捺內(nèi)源DNA酶和多酚氧化酶的作用，防范DNA落解和多酚氧化。在抽提歷程中，顛倒混勻溶液的行動(dòng)不宜太劇烈，以防DNA被剪堵截裂。用氯仿/異戊醇抽提后汲取DNA水相時(shí)，防范把中心卵白層吸起來，以免影響DNA純度。用異丙醇沉淀DNA后，離心轉(zhuǎn)速不宜太大，防范DNA沉淀被壓得太實(shí)，倒霉于70%和90%的乙醇洗滌掃除無機(jī)鹽離子等小分子雜質(zhì)，必需風(fēng)干DNA沉淀，防范乙醇?xì)埩?。?shí)行表現(xiàn)用含高濃度TAB和高濃度Nal的提取緩沖液提取高良姜基因組DNA方案2和方案3的結(jié)果不抱負(fù)，DNA的產(chǎn)率很低，且純度不切合要求。用液氮研磨葉子后，在細(xì)胞核、葉綠體和線粒體的膜布局裂解和DNA開釋出來之前，用洗濯緩沖液200l/LTris-Hl(pH8.0)；50l/LEDTA；250l/LNal；2%PVP-40(/V