層析技術習題

1、層析技術習題一、選擇題 層析圖是指 （C）A.某組分的流出曲線B.某組分的層析峰C.整個層析分離過程所得的各組分流出曲線D.層析分離過程所得的單組分流出體積在層析技術中，分配系數(shù)是指 （A ）A.一種化合物在固相與流動相中的分配達到平衡時的濃度比B.二種化合物在固相與流動相中的分配達到平衡時的濃度比C. 一種化合物在固相與流動相中的分配達到平衡時的質(zhì)量比D.二種化合物在固相與流動相中的分配達到平衡時的質(zhì)量比 TOC o 1-5 h z 下列哪項不是層析技術中的速率理論指出的影響柱效的因素： （D ）A.渦流擴散B.分子擴散C.傳質(zhì)阻力D.理論塔板高度下列哪項不是吸附層析常用的吸附劑： （D ）

2、A.氧化鋁B.硅月里C.活性炭D.瓊脂糖凝膠層析分離混合物的基本原理是： （B ）A.吸附力差異B.分子篩作用C.離子交換D.配體親和差異關于離子交換層析的描述下列哪一項不正確： （B ）A.離子交換劑通常不溶于水B.陽離子交換劑常可離解出帶正電的基團C.陰離子交換劑?？呻x解出帶正電的基團D.陽離子交換劑?？呻x解出帶負電的基團 TOC o 1-5 h z 分離鑒定氨基酸的紙層析屬于 （D）A、親和層析B、吸附層析C、離子交換層析D、分配層析二、是非題（對的打“ / ,錯的打“X”）色譜法就是分離有色物質(zhì)的方法。 （X）層析法的最大特點是分離效率高，但它只能分離各種性質(zhì)相類似的物質(zhì)。（X）固定相

3、是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液）。 （V）分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中分配達到平衡時的濃度比值。 （V）遷移率（或比移值 Rf）是指：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。 （V）在層析分析中，通常是根據(jù)層析峰的位置來進行定性分析，根據(jù)層析峰的面積或高度進行定量分析的。 （V）凝膠層析只能分離分子量相差懸殊的混合物，如Hb與CuSO4（X）Q柱層析中，當柱長 L 一定，理論塔板數(shù) n愈大，柱效愈低。-（X） 填空題、柱層析中，當柱長 L 一

4、定，理論塔板數(shù) n愈大，柱效愈高。柱層析法的定量依據(jù)是層析峰的峰高和峰面積。凝膠層析法分離血紅蛋白和CuS04昆合液，先流出層析柱的是 血紅蛋白一根據(jù)分離的原理不同分類，層析法主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等 凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結構的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的一種層析技術。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)與荷電量不同而進行分離的一種層析技術。一般講，柱層析加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應少于20%的操作容量，體積應低于 5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。四、名詞解釋分配系數(shù)

5、是指溶質(zhì)在相互接觸而互不相溶的兩種溶劑中的溶解達到平衡時（1分），該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比（1分）。分配系數(shù)是代表物質(zhì)種屬的特征常數(shù)，是層析法分離純化生物大分子的主要依據(jù)。在層析技術中，分配系數(shù)是指一種化合 TOC o 1-5 h z 物在固定相與流動相中的分配達到平衡時的濃度比（2分）。K=CS/C m=物質(zhì)在固定相的濃度/物質(zhì)在流動相的濃度（1分）Rf 值層析定性實驗中，比移值（1分）Rf表示：Rf=原點至色斑中心的距離/原點至溶劑前沿的距離（3分）Rf值取決于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)以及兩相的體積比。由于兩相體積比在同一實驗條件下是常數(shù)，所以Rf值主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系

6、數(shù)不同，Rf值也不同。對于某種給定的化合物而言，在標準條件下Rf是常數(shù)。（1分）分子篩利用具有一定孔徑的高分子聚合物制成的、主要用于分離分子量不同的混合物的實驗材料和方法（3分）。如PAGE能使混合物按分子量由小到大依次分離（1分）；而凝膠層析則能使混合物按分子量由大到小先后依次分離（1分）。保留值（retention value ）是表示樣品各組分在層析柱中停留時間的長短（保留時間）或組分流出時所需流動相體積的大?。ūＡ趔w積）。理論塔板等效高度（height to a theoretical plate,HETP），當流動相通過柱的一定高度，在離開這段柱時，流動相中某組分的平均濃度與固定相中

7、的平均濃度可以達到分配平衡，完成這一平衡所需要的柱長稱為理論塔 板等效高度，簡稱板高，以H表示。分離度（resolution ）層析分離效能的總指標Rs的定義為：兩相鄰組份層析峰保留時間之差與兩峰基線寬度總和之半的比值，它可在層析圖中用下式計算而得：Rs= （t R2-tR1）/1/2 （W M+W） =2 / tR/ （Wb1+W）Rs定量地描述了混合物中相鄰兩組份在層析柱中的分離情況。柱效率：混合物被分離的程度 （1分）及單組分被洗脫的體積（1分）。一般用塔板數(shù)n表示（1分）。兩組分t r相差越大、峰寬W越小、塔板數(shù)n越大、平衡次數(shù)越多，柱效率越高（1分）。組分被分離的程度（Rs）及單組分

8、被洗脫的體積（ WboRs越大，Wb越小，柱效越高?？捎美碚撍鍞?shù)n或有效理論塔板數(shù)和有效理論塔板高度來衡量柱效能的高低。對一定的柱長L而言，每達成一次分配平衡所需的理論塔板高度H愈小，理論塔板數(shù)n愈大，柱效能就愈高。當tR2-tR1的值越大（即兩組份的保留值差距越大），Rs值越大，表示出兩峰分得越開，柱分離效能越高，反映了層析作用中的熱力學過程當兩峰的峰寬總和越小 （即兩峰越窄），Rs值亦越大，兩組份分離越好，越集中，表示柱分離效能越高，反映了層析作用中的動力學過程。理論塔板數(shù)n塔板理論把層析柱比擬成一個分儲塔，由許多塔板組成。在每個塔板上，組分在兩相間達成一次平衡。理論塔板數(shù)n就是指物質(zhì)在

9、柱長L的層析柱中可以達成的平衡次數(shù)。對一定的柱長L而言，每達成一次分配平衡所需的理論塔板高度H愈小，理論塔板數(shù)n愈大，柱效能就愈高，所以，可用理論塔板數(shù)n來描述柱的分離效能。n=L/H五、簡述題DEAE千維素離子交換層析分離血清混合蛋白質(zhì)時，采用梯度洗脫法有何優(yōu)點？為什么pH要由高低到低變化而離子強度要由低到高變化？答：DEAE纖維素離子交換層析分離血清混合蛋白質(zhì)時，采用梯度洗脫法有如下優(yōu)點：梯度洗脫，使洗脫能力持續(xù)增強（1分），適用于Dm值相近的各組分的分離（1分）。血清混合蛋白pl有的比較接近，與交換劑親和力相近（1分），采用梯度洗脫法可以提高分離效果（1分）。（2） pH由高低到低變化，

10、正好能使血清蛋白按pl由高到低依次失去電荷（1分）、分子量由大到小相繼被洗脫（1分）。（3）離子強度由低到高變化，使競爭性與離子交換劑結合的能力逐步增強（1分），洗脫能力逐步增強，從而使結合到柱上的血清蛋白能按結合力由弱到強逐步被洗脫。（1分）如果pH由低到高、pl由高低到低變化，所有蛋白質(zhì)全部被一次性洗脫（1分），達不到分離的目的（1分）。簡述離子交換層析的的原理，并舉例說明其在蛋白質(zhì)分離純化中的具體應用。答：離子交換層析是以離子交換劑為固定相。利用其對需要分離的各種離子結合力的差異而將混合物中的不同離子進行分離的層析技術（2分）。離子交換劑是一類具有特殊網(wǎng)狀立體結構的高分子多元酸或多元堿的

11、聚合物，不溶于水和許多有機溶劑。聚合顆粒中帶電荷的酸性或堿性基團作離子交換基團，通過靜電作用與帶相反電荷的離子（反離子）結合。當流動相中存在其帶它相反電荷的離子時，就與先結合在固定相交換基閉上的反離子進行交換（1分）。根據(jù)可交換離子的性質(zhì)，離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑兩大類。陽離子交換劑分子中具有酸性基團，能和流動相中的陽離子進行交換。例：R-SQ -H+Na+- R-S0 3-Na+H （1 分）陰離子交換劑分子中具有堿性基團，能和流動相中的陰離子進行交換。如：R -CH） 30H +CIR- N + （ CH） 3 甲-+0H （1 分）流動相中，不同離子化合物帶電荷多少不同，

12、與離子交換劑相互作用的強弱也不同，當它們被結合到固定相交換基團上后，可以用提高流動相中的離子強度或改變pH的辦法，把它們從離子交換柱上依次洗脫下來，達到分離純化的日的（1分）。二乙氨基乙基纖維素 （DEAE-纖維素）常用來分離中性或酸性蛋白質(zhì)。例如：將血清蛋白質(zhì)加到DEAE纖維素（二乙氨基乙基纖維素，Diethylaminoethyl Cellulose,簡稱：DEAE纖維素）離子交換層析柱上，蛋白質(zhì)分子可與離子交換纖維素之間以離子鍵結合，其結合能力的大小主要決定于蛋白質(zhì)分子所帶的電荷量（1分）。由于血清各種蛋白質(zhì)的等電點不同，因而其荷電量不同，與纖維素結合的能力也不同（1分）。應用梯度洗脫法

13、，逐漸改變洗脫液的pH,使吸附在離子交換纖維素上的蛋白質(zhì)依次失去電荷（1分），并且通過逐步增加流動相的離子強度使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置( 1 分)，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成,從而使血清中的蛋白質(zhì)分成Y -球蛋白、a-和3-球蛋白、清蛋白幾個部分被洗脫下來，以達到分離純化。1 分)3.有一蛋白質(zhì)混合物，分子量相近，等電點分別為：A=9.7 ; B= 6.8 ; C= 4.5 ; D= 8.5 ; E= 7.0 ，在高 pH 時加到4.5.DEAE 纖維素離子交換柱上。如果用逐步降低洗脫液明理由試列舉出三種層析方法，比較其原理和應用范圍。試述離子交換層析法分離血清蛋白質(zhì)的基本原理

14、。pH 的方法來進行洗脫，請指出各蛋白質(zhì)的洗脫順序，并說如果將血清蛋白質(zhì)在高pH 時加到 DEAE 纖維素離子交換柱上，(白蛋白pl是4.0、a球用逐步降低洗脫液pH 的方法來進行洗脫，請指出各蛋白質(zhì)的洗脫順序，并說明理由。蛋白pl是4.8? 5.06、B球蛋白pl是5.4、Y球蛋白Pl是7.1。)凝膠層析有哪些應用？ 凝膠層析技術的應用：(1 ) 作為分析工具： 分子量相差比較大的混合物可以用凝膠層析進行分析。在凝膠層析的基礎上配合使用紙層析或薄層層析技術可以鑒別 出各個析離成分。作為脫鹽工具：高分子 (如蛋白質(zhì)核酸、多糖等) 溶液中的鹽類雜質(zhì)可以借助凝膠層析技術將其除去，這一操作稱為脫鹽，凝膠層析技術脫鹽速度快而完全，而且蛋白質(zhì)、酶類等成分在分離過程不易變性。葡聚糖凝膠 SephadexG-25 因流動阻力小交聯(lián)度適宜，常用于蛋白質(zhì)溶液的脫鹽。高分子溶液的濃縮：用于去除熱原物質(zhì)：熱原物質(zhì)是微生物產(chǎn)生的某些使人發(fā)熱的物質(zhì)，如某些多糖蛋白質(zhì)復合物等，用凝膠處理去離子水，可以得到適于制備注射劑的無熱原質(zhì)水。用于測定高分子物質(zhì)的分子量 用一系列已知分子量的標準樣品放入同一凝膠層析柱內(nèi)，令其在同一條件下進行凝膠層析分離，記下每一種成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)，可得一直線這就是分子量的標準曲線。用于物質(zhì)的分離提純試分別闡述分配層析和吸附層析法分離鑒定