細胞因子檢測方法

1、關(guān)于細胞因子檢測方法第一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月背景細胞因子檢測是判斷機體免疫功能的一個重要指標 疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監(jiān)測等 第二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）依賴性細胞株 ：生物分析法 （二）功能檢測 ：生物分析法 （三）免疫測定 ：免疫分析法 （四）功能測定與抗體抑制 （五）分子雜交技術(shù) ：mRNA的測定 （六）多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測定 第三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月生物分析法 第四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）依賴性細胞株 一些腫瘤細胞株必須依賴于細胞因子方能在體外增殖，如DTLL細胞

2、株依賴IL-2；FDC-PL細胞株依賴于小鼠IL-3；TF-1細胞株依賴于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴細胞株檢測相應(yīng)的細胞因子。這種方法敏感性高，特異性也不錯，但可異的是并非所有細胞因都能找到相應(yīng)的細胞株，因而限制了它的應(yīng)用。第五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）功能檢測 利用一些細胞因子的功能特性，可建立相應(yīng)的活性測定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應(yīng)，腫瘤壞死因子對L929細胞的殺傷作用等。這樣的方法敏感性高，但特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。 第六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫分析法（1）放免實驗（RIA）（2）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

3、 第七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNA的測定 （1）分子雜交實驗 （2）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 第八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月小結(jié)生物學(xué)檢測法比較敏感，又可直接測定生物學(xué)功能，是最可靠的方法，適用于各種實驗?zāi)康模强蒲胁块T最常用的技術(shù)，但需要長期培養(yǎng)依賴性細胞株，檢測耗時長，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。免疫學(xué)檢測法比較簡單，迅速，重復(fù)性好，但所測定的只代表相應(yīng)細胞因子的量而不代表活性，同時敏感度也低于生物活性檢測法（約低10100倍）。分子生物學(xué)法只能檢測基因表達情況，不能直接提供有關(guān)因子的濃度及活性等資料，主要用于機制探討。 第九張，PPT共五十

4、頁，創(chuàng)作于2022年6月影響因素原理與方法靈敏度 準確度和特異性 精密度 ：免疫分析法的精密度較其生物分析法有較大提高 ；批內(nèi)變異通常為20%25%，因此有必要進行2次或3次檢測 標準化 生物分析法和免疫分析法結(jié)合使用 第十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫分析法ELISA細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測 ELISPOT第十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay1 間接ELISA（Indirect ELISA）：用于篩檢抗體（抗特定抗原成分的特異性抗體）。此法是測定抗體最常用的方法。2 夾心ELISA（S

5、andwich ELISA）：用于檢測目的抗原的量。其優(yōu)點是避免了對特異性抗體的直接標記，但增加了操作步驟和測定時間。3 競爭ELISA（Competitive ELISA）用于確定抗原特異性或待檢標本中含交叉反應(yīng)成分時為了提高實驗的特異性而使用的一種方法。根據(jù)標記抗原與同種未標記待測抗原與抗體間發(fā)生競爭性結(jié)合的原理，主要用于測定小分子抗原。第十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月夾心ELISA第1步，包被捕獲抗體到96孔板中，BSA阻斷后加入標準品或者標本 第2步，加入酶標的抗體，結(jié)合被捕獲的細胞因子 第3步，加入酶的底物顯色，酶標儀或者化學(xué)發(fā)光議讀取結(jié)果（OD：optical den

6、sity） 第4步，繪制標準曲線，計算標本中細胞因子的含量 第十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項實驗前：確定試劑盒在有效期內(nèi)仔細閱讀說明書按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）根據(jù)檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑第十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項標本的制備和貯存 ：血清、血漿標本 ：盡快分裝 ，貯存在-70 ，避免反復(fù)凍融 。使用前將標本平衡至室溫，不能用水浴鍋細胞培養(yǎng)上清液：1500g離心1015分鐘去除細胞和細胞殘渣。 第十六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月注意

7、事項試劑盒貯存條件和有效期未開封試劑盒：貯存在2-8 開封/復(fù)溶試劑 ：2-8可以1個月左右標準品：分裝并貯存在-20以下，1個月，避免反復(fù)凍融 微孔板：將未使用的板條用箔紙包好，加上干燥劑沿四周封口。2-8可以1個月左右第十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月檢測方法的進展高通量細胞因子檢測CBA(Cytometric Bead Array)是一種微珠多用途檢測分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細胞儀技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比，此方法可以同時檢測多項指標。用已知的標準品和對照標準曲線就可以

8、得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個樣本的多個數(shù)據(jù)。第十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月夾心ELISA缺點：不能顯示出單個細胞產(chǎn)生細胞因子的同一性和頻率性的直接信息細胞內(nèi)細胞因子的免疫熒光檢測ELISPOT原位雜交單一細胞PCR第十九張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運方法，使得細胞因子聚集、蓄積，增強細胞因子信號，可被流式細胞儀檢測。用途：檢測單個細胞內(nèi)多個細胞因子；并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。 第二十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于202

9、2年6月細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測方法：用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內(nèi)特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。特點：快速簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；高效：在同一細胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據(jù)細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞亞群；接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內(nèi)狀況。第二十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月所需儀器流式細胞儀第二十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月所需試劑

10、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑 熒光標記的細胞因子抗體 激活劑： Phorbol 12-Myristate 13 Acetate (PMA) Ionomycin Staphylococcal enterotoxin B(SEB) 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑：阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，以利于準確檢測細胞產(chǎn)生細胞因子的能力 Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml在激活過程最后4-5小時使用BFA ，過度孵育會導(dǎo)致細胞活力下降 Monensin：3uM /files/FLOWapplicaion/TH1TH2/brefeldin /files/FLOW

11、applicaion/TH1TH2/brefeldin%20a.pdf第二十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月所需試劑 固定劑：含4%的多聚甲醛PBS溶液細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細胞因子固定在細胞內(nèi)，另一方面避免細胞表面抗原丟失。破膜劑：含1皂甙、0.05疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）將細胞膜穿孔，以利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內(nèi)，與相應(yīng)的細胞因子結(jié)合 第二十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法人IFN-：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺

12、激4-24 小時人TNF-：使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激小時人IL-2：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小時小鼠IL-2：細胞在包被抗小鼠CD3抗體(25 ug/ml) 的培養(yǎng)板中，使用抗CD28 抗體(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小時第二十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月基本過程（以全血為例） 、收獲細胞 、阻斷Fc受體：消除非特異性的結(jié)合染色、細胞表面染色、固定和破膜、細胞內(nèi)染色 第二十

13、六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫分析法ELISA細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞儀檢測 ELISPOT第二十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT Enzyme-linked Immunospot Assay 第二十九張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT發(fā)展歷史1963年：Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),這項技術(shù)可用于檢測并計數(shù)單個抗體形成細胞。 1983年：Czerkin

14、sky 等成功地檢測出因受刺激而分泌抗體的B細胞頻率接近體內(nèi)實驗的環(huán)境，藉由檢測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T亞群的大小，預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應(yīng)。 1996：俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），解決了低敏感度的問題。Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性 Herr用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assisted video image analysis

15、 ,CVIA) 自動分析TNF-酶聯(lián)免疫斑點的大小和數(shù)量,計算與負載抗原肽的靶細胞接觸后PBMC中抗原特異性CD8+T細胞的數(shù)量 Vaquerano等將數(shù)碼相機和計算機結(jié)合起來,開發(fā)出類似的斑點計數(shù)系統(tǒng),認為當每孔斑點數(shù)大于100時,這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時間第三十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月檢測原理 細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，

16、通過顯微鏡或ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。 第三十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D1ELISPOT包被程序 每孔加入15l 70%的乙醇預(yù)濕30秒，PVDF膜變成半透明狀（加樣注意?。┘尤?00l去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留每孔加入100l包被抗體工作液，4C包被過夜 第三十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D2傾倒包被液，用PBS洗滌5次，最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干200l試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37C封閉1小時傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進行細胞培養(yǎng)。（也可以用PBS緩沖

17、液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4C保存，可以在4C保存數(shù)周。） 第三十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D2鋪細胞,加入刺激物，培養(yǎng)正對照（PHA刺激）10l，終濃度4ug/mL 樣品 負對照（不加刺激物）背景負對照（不含細胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑）：100l的U-Cytech無血清培養(yǎng)基 設(shè)置2-4個孔的重復(fù)第三十六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D2以前做的封閉，可加入200l的U-Cytech無血清培養(yǎng)基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復(fù)一次加入不同濃度的細胞，100l/well，細胞在孔中的分布要盡量均勻

18、加入刺激物（配制成10X終濃度，10l/well）到實驗孔 不要再震動或者拍擊ELISPOT板 蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37C培養(yǎng)18-24hr在整個培養(yǎng)過程中避免移動、碰撞培養(yǎng)板。避免開關(guān)培養(yǎng)箱的箱門！ 第三十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D3培養(yǎng)后操作 傾倒孔內(nèi)的細胞及培養(yǎng)基，低滲法將細胞裂解：每孔加200l冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘200l的PBST洗滌10遍，洗滌最后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干稀釋檢測抗體，每孔加入100L生物素標記的檢測抗體，37C 1小時200l 的PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時，將PVDF膜板的背

19、面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干 第三十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D3在一個淺托盤中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。（注意：一定要將膜的背面和塑料保護層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜?。?第三十九張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D3稀釋酶標的鏈霉親和素，每孔加入100l，37C 1小時200l的 PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干解凍已配好的

20、顯色液，每孔加入100l的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。 第四十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISPOT標準操作程序 D3待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂!ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點計數(shù)，并記錄斑點的各種參數(shù)，作統(tǒng)計分析。 第四十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果判定儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影

21、像；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數(shù)目使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估細胞因子分泌的多寡?？朔鹘y(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點ImmunoSpot影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數(shù)目、每個小孔中的平均斑點數(shù)目、每個小孔中斑點大小的直方統(tǒng)計圖。第四十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果判定計算機可以利用斑點的深淺、是否以中心為原點向四周減淡等特征對細胞分泌動力學(xué)特征進行分析 第四十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)優(yōu)勢-與ELISAELISA

22、 通過顯色反應(yīng)，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過計算機輔助的分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)， 1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。 第四十四張，PPT共五十頁，

23、創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)優(yōu)勢-與有限稀釋法（limiting dilution analysis , LDA） LDA：對特異性CTL細胞進行定量,免疫反應(yīng)動力學(xué)和記憶毒性T淋巴細胞(memorial CTL, mCTL) 亞群的細胞周期需高強度抗原刺激, 這會加快效應(yīng)CTL(eCTL)凋亡,且不能定量測定eCTL細胞數(shù)量或測定值偏低較繁瑣,培養(yǎng)時間可長達23周，而且很容易造成T細胞數(shù)量損失。 第四十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)優(yōu)勢-與四聚體法（Tetramer）MHC-類分子抗原肽四聚體法定量檢測抗原特異性CTL 的“金標準”優(yōu)勢：迅速、直接、靈敏且特異性強,即使當體內(nèi)mCTL水平低于1%,用MHC-抗原肽四聚體法仍可直接測到準確的值,比LDA 敏感度要高510倍該技術(shù)的