幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的研究

1、幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的研究【摘要】本研究評價幾種臨床常用的抗腫瘤藥物順鉑DDP、羥基喜樹堿(HPT)、高三尖杉酯堿(HHT)和米托蒽醌(IT)在白血病治療中的作用，并闡發(fā)其在誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用，為白血病的臨床治療提供新的理論根據(jù)和思緒。用AnnexinV/PI雙參數(shù)流式闡發(fā)要領(lǐng)，檢測這幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡和殞命的效應(yīng)。結(jié)果表白：IT和HPT在加藥處置懲罰早期4小時(P0.05)和后期第8小時(P0.05)都有顯著的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。HHT有顯著誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的結(jié)果，但各劑量組之間無明顯差異。DDP在高濃度和長時間作用時才表

2、現(xiàn)較弱的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，顯著弱于前3者。種種藥物作用后均未不雅察到顯著的細(xì)胞殞命效應(yīng)。結(jié)論：IT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作用最明顯，AnnexinV流式闡發(fā)要領(lǐng)可作為一種可靠的臨床藥物挑選的要領(lǐng)。【關(guān)鍵詞】抗癌藥物；細(xì)胞凋亡；Jurkat細(xì)胞系；AnnexinVEffetfSeveralAnti-turDrugsnApptsisIndutininJurkatellLineKeyrdsanti-turdrug;apptsis;Jurkatellline;AnnexinV化療是腫瘤治療的一種緊張要領(lǐng)，新的抗腫瘤藥物也不竭地涌現(xiàn)。海內(nèi)涵上個世紀(jì)90年代上市的抗癌藥物中化學(xué)合成藥米托蒽醌(IT)、羥基

3、脲溫順鉑(DDP)等少數(shù)幾種抗癌藥物，通過與DNA分子團(tuán)結(jié)按捺核酸合成引起細(xì)胞殞命，這類藥物稱之為細(xì)胞周期非特異性藥物。本研究選用米托蒽醌(IT)、順鉑(DDP)、羥基喜樹堿(HPT)、高三尖杉酯堿(HHT)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，并通過AnnexinV/PI法檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞殞命比例，闡發(fā)差異作用時間以及差異藥物濃度對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響。質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料Jurkat細(xì)胞系由本實行室保存。順鉑DDP為齊魯制藥產(chǎn)物、羥基喜樹堿HPT為黃石飛云制藥廠產(chǎn)物、高三尖杉酯堿HHT為杭州民生藥業(yè)公司產(chǎn)物、米托蒽醌I(xiàn)T為浙江瑞新藥業(yè)公司產(chǎn)物；RPI1640為Invitrgen產(chǎn)物；AnnexinV

4、FIT/PI試劑盒購自晶美生物公司；貝克曼流式細(xì)胞闡發(fā)儀EliteEXP。誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡Jurkat細(xì)胞在5%2孵箱造就至對數(shù)生恒久，鏡下計數(shù)為1106/l，參加24孔板，每孔1l細(xì)胞懸液。用無血清細(xì)胞懸液將順鉑、羥基喜樹堿、高三尖杉酯堿和米托蒽醌藥物配制成1g/l溶液；每組藥物別離設(shè)4個濃度：12.5、25、50、100g/l；別離參加24孔造就板，作3個復(fù)孔。置于52孵箱造就。AnnexinV/PI流式雙參數(shù)闡發(fā)1-3別離于參加藥物作用2、4和8小時，汲取造就細(xì)胞懸液，用4預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用250l團(tuán)結(jié)緩沖液重懸細(xì)胞，使其濃度為1106/l；取100l細(xì)胞懸液，加5lAn

5、nexinV/FIT和10l(20g/l)的碘化丙錠；混勻后室溫避光孵育15分鐘；用PBS洗滌2次，舉行流式細(xì)胞儀FAS闡發(fā)。AnnexinV-FIT/PI雙參數(shù)舉行調(diào)試，以此條件舉行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死率檢測。圖1-5橫坐標(biāo)表現(xiàn)熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表現(xiàn)細(xì)胞數(shù)，圖中兩個峰中的左邊峰表現(xiàn)陰性峰，右峰表現(xiàn)凋亡峰，右峰曲線下面積越大凋亡就越多。按照所測數(shù)據(jù)盤算細(xì)胞凋亡率和繼發(fā)性壞死率。統(tǒng)計學(xué)闡發(fā)各組細(xì)胞凋亡率均取3個樣本的均值，以XSD表現(xiàn)，多個均數(shù)的兩兩比力接納?中國醫(yī)學(xué)百科全書醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)?統(tǒng)計軟件包(第三版)PES3.1軟件舉行查驗。結(jié)果DDP對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用DDP各劑量組與比擬組未處

6、置懲罰組比擬，在其劑量為12.5g/l時，各個作用時間點上Jurkat細(xì)胞凋亡率均無顯著變革；劑量為25g/l和50g/l時，在2小時和4小時Jurkat細(xì)胞凋亡率也無顯著變革，而在作用8小不時Jurkat細(xì)胞凋亡率才有顯著增高，別離為13.6%和23.9%，與比擬組比擬有明顯差異P0.05。當(dāng)DDP藥物濃度增大至100g/l時，作用2小時和4小不時，Jurkat細(xì)胞凋亡率無變革，在8小不時Jurkat細(xì)胞凋亡率為19.9%，與50g/l劑量比擬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率不單沒有顯著差異，并且有所低落圖1，這表白DDP的作用有藥物飽和效應(yīng)。HHT對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用HHT各劑量組的細(xì)胞凋亡率

7、與比擬組未處置懲罰組比擬均有顯著增高P0.05。Jurkat細(xì)胞凋亡率與藥物劑量干系不顯著，但與作用時間顯著成正比。12.5g/lHHT作用2、4和8小不時Jurkat細(xì)胞凋亡率別離是4.9%、20.4%和35.4%(P0.05)；25g/lHHT時別離為5.5%、12.1%和27.2%；50g/lHHT時別離為5.8%、12.2%和33.0%；100g/lHHT時別離是5.7%，12.1%和35.0%(P0.05)。差異藥物濃度HHT在同一時間點之間誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率沒有顯著差異圖2。IT對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用與比擬組未處置懲罰組比擬，IT各劑量組在作用2小不時Jurkat

8、細(xì)胞凋亡率無顯著差異，但隨作用時間延伸均有顯著增高P0.05。12.5g/l劑量組作用2、4和8小不時Jurkat細(xì)胞凋亡率別離是4.2%、20.5%和52.4%(P0.05)，25g/l組別離為4.9%、30.1%和68.9%，50g/l組別離是7.2%、37.9%和81.8%(P0.05)圖3，100g/l組別離為6.6%，41.5%和84.1%，各作用時間點之間差異均有明顯差異P0.05圖4。Jurkat細(xì)胞凋亡率在藥物低劑量時隨劑量增大顯著增高；100g/l組作用效應(yīng)與50g/l劑量組沒有顯著差異，表現(xiàn)有劑量飽和效應(yīng)。HPT對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用HPT各劑量組與比擬組未處置懲

9、罰組比擬，Jurkat細(xì)胞凋亡率均有顯著增高P0.05，Jurkat細(xì)胞凋亡率隨藥物劑量增大和時間延伸而顯著增高，12.5g/lHPT劑量組作用2、4和8小不時Jurkat細(xì)胞凋亡率別離是3.4%、20.9%和30.3%(P0.05)；而25g/l組別離為3.7%、19.1%和30.3%；50g/l組別離是5.9%、23.8%和44.6%(P0.05)，100g/l組別離是3.0%、15.8%和55.7%(P0.05)。HPT雷同劑量差異作用時間點的Jurkat細(xì)胞凋亡率均有明顯差異(P0.05)圖5；HPT差異劑量同一作用時間點的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率在2小時與4小時間沒有明顯差異，而兩

10、者與8小時作用比擬均有明顯差異(P0.05)。各藥物組間誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的比力順鉑、高三尖杉酯、米托蒽醌和羥基喜樹堿4種藥物間差異劑量組在作用2小不時誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的凋亡率無顯著差異，在4小時和8小不時各組間均有明顯差異(P0.05，圖6。藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的強(qiáng)度依次為IT、HPT、HHT和DDP。各藥物組誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞殞命各藥物組均未產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞殞命的征象。DDP誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞殞命的效應(yīng)隨藥物濃度的增高和作用時間的延伸而加強(qiáng)，在藥物濃度為25、50和100g/l，作用8小不時誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞殞命率別離為7.6%、9.9%和10.3

11、%。12.5g/lHHT短時間和長時間作用時細(xì)胞殞命效應(yīng)均不顯著，只在藥物濃度為25、50和100g/l，作用4小不時表現(xiàn)薄弱的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞殞命的效應(yīng)，細(xì)胞殞命率別離為6.6%、5.2%和6.6%。IT只在低藥物濃度12.5g/l和25g/l作用8小不時細(xì)胞殞命率別離為4.0%和4.5%圖7，藥物濃度增高時卻并未產(chǎn)生顯著的細(xì)胞殞命。而HPT那么只在增高藥物濃度至50g/l和100g/l，長時間作用8小不時才產(chǎn)生細(xì)胞殞命，細(xì)胞殞命率別離為5.0%和9.6%。詳見附表。Table.Effetfanti-turdrugsnapptsisfJurkatells(略)討論多種化療藥物可以誘導(dǎo)腫瘤

12、細(xì)胞凋亡，如米托蒽醌(IT)、順鉑(DDP)、羥基喜樹堿(HPT)，高三尖杉酯堿(HHT)等。有文獻(xiàn)報道米托蒽醌可誘導(dǎo)人髓系白血病細(xì)胞凋亡4，并漸漸用于白血病的治療。DDP曾用于治療卵巢癌、前線腺癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、惡性淋巴瘤、乳腺癌、頭頸部鱗癌、甲狀腺癌及成骨血瘤等多種實體腫瘤，均表現(xiàn)出精良的療效，其機(jī)制是損傷線粒體成效、使DNA斷裂和按捺細(xì)胞發(fā)育5，比來有文獻(xiàn)報道，DDP可通過引起D95聚攏成簇進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡6。然而，其較強(qiáng)的腎毒性限定了其臨床利用。羥基喜樹堿(HPT)和高三尖杉脂堿(HHT)均是從植物中提取的生物堿，具有明顯的抗癌活性。HPT在臨床上重要用于結(jié)腸、直腸癌、肺癌

13、及白血病等惡性腫瘤的治療，也有很強(qiáng)的誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞和消化體系腫瘤細(xì)胞凋亡的作用7，8。臨床證實，HHT對急性粒細(xì)胞白血并急性單核細(xì)胞白血并紅系白血病等種種急性非淋巴性白血病及慢性粒細(xì)胞白血病均有較好的療效。研究表白，HHT可誘導(dǎo)人野生型P53白血病細(xì)胞、HL-60，K562和Jurkat細(xì)胞等凋亡，誘導(dǎo)機(jī)制大概是通過粉碎或改變線粒體跨膜電位或細(xì)胞色素、AIF的開釋和aspase的活化等9-11，同時另有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化和按捺轉(zhuǎn)移的作用12。本研究按照比年的研究結(jié)果和臨床白血病治療的題目和近況，用可靠的AnnexinV/PI流式雙參數(shù)闡發(fā)要領(lǐng)，比力了幾種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的作

14、用，為辦理臨床白血病治療的題目提供新的根據(jù)和思緒。細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的早期，膜磷脂酰絲氨酸PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種磷脂團(tuán)結(jié)卵白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)表露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜團(tuán)結(jié)。因此，AnnexinV被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的敏捷指標(biāo)之一。在細(xì)胞產(chǎn)生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的產(chǎn)生早于細(xì)胞核的變革。本研究團(tuán)結(jié)斷定細(xì)胞死活的核酸染料PI，利用AnnexinV/PI流式雙參數(shù)闡發(fā)來區(qū)分凋亡細(xì)胞與殞命細(xì)胞，檢測幾種實行藥物誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡和殞命的效應(yīng)。本研究結(jié)果表現(xiàn)，各藥物均表現(xiàn)差異程度的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。DDP小劑量時無顯著

15、誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，只在大劑量長時間作用時才表現(xiàn)出誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)。HHT和IT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)均隨藥物劑量增大顯著增高，但HHT各劑量組在差異時間點細(xì)胞凋亡率無顯著變革，IT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)隨藥物作用時間延伸而顯著加強(qiáng)。HPT組差異藥物劑量同一作用時間點誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡率在2小時與4小時間沒有明顯差異，但作用8小不時均有明顯差異。IT誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡效應(yīng)的強(qiáng)度顯著強(qiáng)于其他3種藥物，DDP只表現(xiàn)薄弱的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。前3種藥物隨劑量增大均表現(xiàn)出藥物飽和效應(yīng)。各藥物組均未表現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞殞命的變革。DDP和HPT只在高藥物濃度長時間作用時才表現(xiàn)薄弱的細(xì)胞殞命效應(yīng)。HHT短時間和長時間作用時細(xì)胞殞命效應(yīng)均不顯著，只在藥物作用4小不時表現(xiàn)薄弱的誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞殞命的效應(yīng)。IT卻只在