雙歧桿菌分離培養(yǎng)鑒定

1、1設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱：36C1C。2.2氣相色譜儀配FID檢測器。2.3冰箱：2C5C。2.4天平：感量0.1g。2.5無菌試管：18mmX180mm、15mmX100mm。2.6無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200口L1000口L)及配套吸頭。無菌錐形瓶：500mL、250mL。顯微鏡2培養(yǎng)基和試劑BS培養(yǎng)基PYG培養(yǎng)基TPY培養(yǎng)基NPNL培養(yǎng)基X-GAL培養(yǎng)基氟化鈉：化學(xué)純。碘乙酸鈉或碘乙酸鉀：化學(xué)純。果糖-6-磷酸鹽：化學(xué)純。鹽酸羥胺(HydroxyLamine-HCl)：化學(xué)純

2、。三氯乙酸(TCA):化學(xué)純。三氯化鐵(FeCl36H2O)：化學(xué)純。甲醇:分析純。三氯甲烷：分析純。硫酸：分析純。冰乙酸：分析純。乳酸：分析純。3.17乙酸標(biāo)準溶液：吸取分析純冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,標(biāo)定，標(biāo)定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1mol/L。3.18乙酸標(biāo)準使用液:將經(jīng)標(biāo)定的乙酸標(biāo)準溶液用水稀釋至0.01mol/L。3.19乳酸標(biāo)準溶液：吸取分析純?nèi)樗?.4mL，移入100mL容量瓶中,加水至刻度,標(biāo)定，標(biāo)定方法見附錄B.2,此溶液濃度約為1mol/L。3.20乳酸標(biāo)準使用液：將經(jīng)標(biāo)定的乳酸標(biāo)準溶液用水稀釋至0.01mol/L。3雙歧桿菌的分離和培

3、養(yǎng)在無菌室內(nèi)無菌稱取lg雙歧桿菌制劑，根據(jù)標(biāo)示的活菌數(shù)量，用滅菌稀釋液進行10倍梯度稀釋至104-107,然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL瓊脂平板上，放于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48到72小時.然后挑選菌落特征為光華、凸圓、邊緣整齊、白色或乳脂色、質(zhì)地柔軟的中小菌落，接種于TPY瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)。待長出菌落后，每個平板選5個以上的特征菌落，先進行革蘭氏染色，挑選具有雙歧桿菌形態(tài)等特征的菌落，再進行需氧和厭氧培養(yǎng)，剔除需氧和厭氧都生長的菌落，選取僅厭氧培養(yǎng)生長的菌落，進一步在TPY瓊脂平板上純化菌株直至鏡檢為純菌株。分純后的菌株進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其形態(tài)，然后進行鑒定，經(jīng)鑒定是雙歧桿菌的

4、菌株在TPY液體培養(yǎng)基中增菌至平穩(wěn)期，4C，6000gX15min條件下離心收集菌體分散于20%滅菌脫脂中，然后在一3040C條件下凍干，凍干完成后，在真空條件下壓蓋，T8C貯存。區(qū)3-1從雙歧桿葡制捌中分離瑕歧桿菌4厭氧培養(yǎng)法液體中的厭氧培養(yǎng)采用亨蓋特厭氧培養(yǎng)技術(shù)(Min,1999;Chung,1997)。將配置好的培養(yǎng)基中加入0.01%亞甲基藍作為氧指示劑，然后將其加熱至沸騰，同時通入高純氮氣，5分鐘后迅速將加熱的培養(yǎng)基放入冷水中冷卻至45C,亞甲基藍顯示為無色則表示已經(jīng)達到厭氧，迅速蓋上橡膠塞，以上操作過程中均保持高純氮氣的不斷通入。然后將培養(yǎng)基置于121C，滅菌21分鐘。5雙歧桿菌的鑒

5、定鏡檢在基礎(chǔ)改良MRS培養(yǎng)基中添加X-Gal,對雙歧桿菌進行檢測雙歧桿菌單獨表面涂布呈白色或淺蘭色，標(biāo)準雙歧桿菌表面涂布37C48h培養(yǎng)后，雙歧桿菌呈白色或淺蘭色，邊緣整齊，表面隆起部分顯白色，菌落背面觀察呈蘭色底暈，隨機挑取5個白色菌落經(jīng)革蘭氏染色涂片鏡檢，該菌為革蘭氏陽性,呈各種分叉,V形,棍棒狀,單個,成對,或鏈狀排列,多種不規(guī)則形狀,即可基本判定為雙歧桿菌。6形態(tài)特征菌株在TPY固體平板上厭氧培養(yǎng)24小時，然后進行革蘭氏染色，對其個體形態(tài)特征進行顯微觀察。同時把菌株接種平板上培養(yǎng)48小時，進行菌落形態(tài)觀察。通過菌落及菌體形態(tài)可以看出:雙歧桿菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水樣半透明或不透明

6、，邊緣整齊，凸起。菌體革蘭氏染色呈陽性，并呈多形態(tài)性，菌體不規(guī)則，傳代后，“V”字形和“Y”字形較少見。7生理生化檢驗糖發(fā)酵試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將雙歧桿菌合適稀釋度的稀釋液20mL接種到各糖發(fā)酵管中，37C48h厭氧培養(yǎng)。觸酶試驗:挑取固體培養(yǎng)基18-24h內(nèi)的菌落1接種環(huán)，置于潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴（新鮮配制），觀察結(jié)果。明膠液化試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將待測菌株接種到裝有明膠培養(yǎng)基的厭氧管中，放入37C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天，然后置于4C30分鐘。同時準備兩只未接種的厭氧管進行對照。吲哚試驗:將菌液置于37C恒溫箱中培養(yǎng)4天，然后在菌液中加入吲哚試劑lmL。陽性:培養(yǎng)物與試劑接

7、觸處產(chǎn)生一紅色的環(huán)狀物。陰性:培養(yǎng)物仍為黃色。硝酸鹽還原試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將待測菌株接種于硝酸鹽還原培養(yǎng)基中，置于37C恒溫箱中厭氧培養(yǎng)，分別在3d，5d時進行檢測。檢測時取培養(yǎng)液約O.smL于干凈的試管中，先后滴入格里斯氏試劑A液、B液各2滴，如無紅色出現(xiàn)，則加1-2滴二苯胺試劑，若出現(xiàn)藍色，此菌株進行下一步檢測。同時對培養(yǎng)液進行鏡檢，菌生長良好，且空白對照管加入格里斯氏試劑無紅色出現(xiàn)時，以上檢測結(jié)果有效。淀粉試驗:在無菌操凈臺內(nèi)將雙歧桿菌合適稀釋度的稀釋液1OOUL接種到淀粉固體培養(yǎng)基上，用L棒涂布均勻，37C48h倒置厭氧培養(yǎng)。附：糖發(fā)酵培養(yǎng)基:將PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1%的各種糖，再加

8、溴甲酚紫一滴，115C高壓滅菌。觸酶試劑:3%過氧化氫溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。明膠試劑:將15%的明膠加入PY培養(yǎng)基中，115C高壓滅菌。吲哚試劑:對二甲基氨基苯甲醛1g95%酒精95mL濃鹽酸50mL硝酸鹽試劑:PYG培養(yǎng)基內(nèi)加入1%。硝酸鉀。格里斯氏試劑:A液:對氨基苯磺酸0.5g，10%稀醋酸150mLB液：a-萘酚0.1g，蒸餾水20mL，10%稀醋酸15OmL二苯胺試劑:對苯胺0.5g溶于IOOmL濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋淀粉試劑:在PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入2%，115C高壓滅菌。雙歧桿菌的分離培養(yǎng)鑒定方法流程操作步驟樣品制備5.1.1樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。5.1.2以

9、無菌操作稱取25g（或mL）樣品，置于裝有225mL生理鹽水的滅菌錐形瓶內(nèi)，制成1:10的樣品勻液。5.2稀釋步驟5.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1.0mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。5.3純培養(yǎng)挑取3個或以上的菌落接種于BBL瓊脂平板，厭氧，36C1C培養(yǎng)48h。鏡檢及生化鑒定：涂片鏡檢：雙歧桿菌菌體為革蘭氏染色陽

10、性，不抗酸、無芽孢，無動力，菌體形態(tài)多樣，短桿狀、纖細桿狀或球形，可形成各種分支或分叉形態(tài)。生化鑒定：選取純培養(yǎng)平板上的三個單個菌落，分別進行生化反應(yīng)檢測，不同雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng)見表1。5.4果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）的測定，見附錄B。5.5氣相色譜法測定雙歧桿菌的有機酸代謝產(chǎn)物,見附錄B揮發(fā)性乙酸的測定:純培養(yǎng)物2mL加50%硫酸0.10.2mL酸化-連續(xù)倒置混勻100次加ImL乙醚充分振搖5-10min離心5min取上層0.5.mL至另一有少許無水氯化鈣的干凈試管中取2pL進行氣相色譜分析。非揮發(fā)性乳酸的測定:純培養(yǎng)物2mL加50%硫酸0.1一O.2mL酸化加lmL甲醇溶

11、液60C水浴1小時加0.5mL氯仿離心5min取出試管用毛細吸管吸取底層0.2-0.4UL至另一有少許無水氯化鈣的干凈試管中取2pL進行氣相色譜分析。6報告根據(jù)5.3項鏡檢及生化反應(yīng)結(jié)果、5.4項果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）陽性結(jié)果和5.5項雙歧桿菌的有機酸代謝產(chǎn)物乙酸與乳酸微摩爾之比大于1A.1BS培養(yǎng)基A.1.1成分用量酵母粉6.0g胰酶水解酪蛋白5.0g植物蛋白胨3.0g多胨3.0g葡萄糖10.0g可溶性淀粉0.5g蛋白胨7.0g西紅柿浸出液200.0mL葉溫801.0mL肝浸液150mL瓊脂20.0g溶液A10mL溶液B5mL蒸餾水800mLL-半胱氨酸鹽酸0.5gBS添加液

12、50mLA.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸鹽溶液的配置：稱取半胱氨酸0.5g,加入1.0mL鹽酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸鹽溶液。A.1.2.2西紅柿浸出液的制備：將新鮮的西紅柿洗凈后稱重切碎，加等量的蒸餾水在100C水浴中加熱，攪拌90min,然后用紗布過濾，校正pH7.0,將浸出液分裝后，121C高壓滅菌15min20min。A.1.2.3制法：(1)除BS添加液外，其他成分加熱溶解，調(diào)pH至7.2，115.6C高壓滅菌20min，冷至50C時加BS添加液，混勻傾注平皿。(2)BS添加液:丙酸鈉30g加入滅菌燒瓶中，加滅菌蒸餾水80mL，待溶解后加硫酸新霉素400mg，巴龍霉素

13、100mg，LiCl6g，再加滅菌蒸餾水至100mL，4C保存。溶液A:KHPO25gKHPO25g水250g2424溶液B：MgSO7HO10gFeSO7HO0.5gNaC10.5gMnSO0.337g水250g42424NPNL培養(yǎng)基瓊脂15g葡萄糖10g牛肉提取物3g肝浸液150ml植物蛋白胨3g蛋白胨10g溶液A10ml溶液B5ml吐溫-801g胰蛋白酶5g酵母提取物5g可溶性淀粉0.5gNPNL溶液10mlL-半胱氨酸鹽酸0.5g去離子水815ml溶液A,溶液B同上NPNL溶液LiCl3g奈啶酮酸15g硫霉素100mg硫入龍霉素200mg水1000mA.2PYG液體培養(yǎng)基A.2.1成

14、分用量蛋白胨10.0g葡萄糖2.5g酵母粉5.0g半胱氨酸-HC10.25g鹽溶液20.0mL維生素K1溶液0.5mL氯化血紅素溶液2.5mL加蒸餾水至500.0mLA.2.2制法A.2.2.1鹽溶液的配制：稱取無水氯化鈣0.2g,硫酸鎂0.2g,磷酸氫二鉀1.0g,磷酸二氫鉀1.0g,碳酸氫鈉10.0g,氯化鈉2.0g,加蒸餾水至1000mL。A.2.2.2氯化血紅素溶液（5mg/mL）的配制：稱取氯化血紅素0.5g溶于1mol/L氫氧化鈉1.0mL中，加蒸餾水至1000mL,121C高壓滅菌15min20min。A.2.2.3維生素K1溶液的配制：稱取維生素K11.0g,加無水乙醇99mL

15、,過濾除菌，冷藏保存。A.2.2.4制法：除氯化血紅素溶液和維生素K1溶液外,A.2.1其余成分加入蒸餾水中,加熱溶解,校正pH6.0,加入中性紅溶液。分裝后121C高壓滅菌15min20min。臨用時加熱熔化瓊脂，加入氯化血紅素溶液和維生素K1溶液，冷至50C使用。A.3TPY液體培養(yǎng)基A.3.1成分用量水解酪蛋白10.0g植物胨5.0g酵母粉2.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO47H2O）2.0g氯化鎂(MgCl26H2O)0.5g硫酸鋅(ZnSO47H2O)0.25g氯化鈣（CaCl2）0.15g氯化鐵（FeC13）0.1mg葉溫-801.0mL蒸餾水至1000.0mLA.3.2

16、制法：A.3.2.1半胱氨酸鹽溶液的配置：稱取半胱氨酸0.5g,加入1.0mL鹽酸，使半胱氨酸全部溶解,配制成半胱氨酸鹽溶液。A.3.2.2制法：將A.3.1成分加熱溶解，然后加入半胱氨酸鹽溶液，校正pH6.50.1,分裝后121C高壓滅菌15min20min表1雙鹼桿菌菌種主要生比反應(yīng)號項目商歧貞歧桿閒塑兒.雙墳桿葡繪収歧桿葡18.Jr9jfgirffl育呑垃歧桿萬歳物取歧桿老(jB短躍歧桿胡(日.亦肌#)I甘油230冏拉伯稱4L-阿拉旳糊+%n-K狂豐*豐6D木惦十+d+7!-水稱S阿樂尊9P甲基-D術(shù)58成!1)-半乳弟d+-+d+II圧重薔卿-+4-+-+L2d+dd+I3m甘禪糖豐豐

17、14山契幽1516衛(wèi)矛暉號-IIB.旳曲HXL巧（丘扭叫卵冊肯吝収克桿畫（B.召占。啟$豊芒耳計反、蛾妝艮復(fù)桿菌IjB.心制打應(yīng)的中上沖?V訃264-27D-纖綻二罐d2Sm覺芽糖亠4*斗29D-乳械+4-十+30D-出二權(quán)4-+4-1-+31D-貢U亠4+32D-海浜播（.戛対33菊塘菊根勒34D-松三謹+*J5D-柞軒槪*七36淀紛37肝糖堆恥38桶1?39龍膽二榷十豐+40二轄41附錄B果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶與雙歧桿菌的有機酸代謝產(chǎn)物檢測方法B.1果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）測定B.1.1試劑（1）0.05mol/L磷酸鹽緩沖液pH6.5+500mg/L半胱氨酸-HC1。（2

18、）6mg/mL氟化鈉+10mg/mL碘乙酸鈉或鉀（3）果糖-6-磷酸鹽（鈉鹽，70%-98%純度）80mg/mL水溶液。（4）鹽酸羥胺（HydroxyLamine-HCl）139mg/mL水溶液，使用時以NaOH中和至pH6.5。（5）15g/100mL三氯乙酸（TCA）水溶液。（6）4mol/LHC1。（7）0.5g/100mLFeCl36H2O溶于0.1mol/LHCl中。B.1.2檢測步驟挑取BBL瓊脂平板上純培養(yǎng)的雙歧桿菌接種到TPY液體培養(yǎng)基，厭氧，36C1C培養(yǎng)72h3h。從10mLTPY培養(yǎng)液于3000r/min離心5min,棄上清液，細胞用上述試劑（1）洗滌2次，然后懸浮于1.

19、0mL試劑（1）中。將盛有細胞懸液的容器置于一冰浴內(nèi)，用超聲波處理20min,以破碎細胞。然后在超聲波處理物中加入試劑（2）和試劑（3）各0.25mL,置于37C保溫30min。保溫后在溶液中入1.5mL試劑（4）,置室溫5min。加入試劑（5）和試劑（6）各1mL,置室溫5min。然后加入1mL試劑（7）觀察溶液顏色B.1.3結(jié)果判定：經(jīng)以上程序測定如顯紅褐色或紅紫色，則果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶為陽性,否則為陰性。B.2氣相色譜法測定雙歧桿菌的有機酸代謝產(chǎn)物B.2.1雙歧桿菌培養(yǎng)液制備挑取BBL瓊脂平板上純培養(yǎng)的雙歧桿菌接種于PYG液體培養(yǎng)基,同時用未接種菌的PYG液體培養(yǎng)基做空白對照,厭氧

20、,36C1C培養(yǎng)48h。B.2.2標(biāo)準液的配制B.2.2.1乙酸標(biāo)準溶液：準確吸取乙酸5.70mL加水稀釋至100.0mL,搖勻,進行標(biāo)定，配成約1.0mol/L的乙酸標(biāo)準溶液。標(biāo)定方法為：準確稱取乙酸3g,加水15mL,酚酞指示液2滴,用1mol/mL氫氧化鈉溶液滴定,并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。1mL1mol/mL氫氧化鈉溶液相當(dāng)于60.05mg的乙酸。B.2.2.2乙酸使用液：將經(jīng)標(biāo)定的乙酸標(biāo)準溶液用水稀釋至20.0mmol/L。B.2.2.3乳酸標(biāo)準溶液:準確吸取含量為85%90%的乳酸0.84mL,加水稀釋至100.0mL,搖勻，配成1.0mol/L的乳酸標(biāo)準溶液。標(biāo)定方法為：準確稱取乳酸1g,加水50mL,加入1mol/mL氫氧化鈉滴定液25mL,煮沸5min,加入酚酞指示液2滴，同時用0.5mol/mL用1mol/mL硫酸滴定液滴定,并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。1mL1mol/mL氫氧化鈉溶液相當(dāng)于90.08mg的乳酸。B.2.2.4乳酸使用液：將乳酸標(biāo)準溶液用水稀釋至20.0mmol/L。并有機相，于40C水浴中用氮氣吹至少量溶液存在，用丙酮定容至1.0mL,混勻后備用。同樣操作步驟處理乙酸標(biāo)準和空白培養(yǎng)液。B.2.3方法B.2.3.1乙酸的處理取雙歧桿菌培養(yǎng)液2.0mL3.0mL放入10mL離心管中,加入0.2mL