分子生物學(xué)檢驗(yàn)：基因組結(jié)構(gòu)與特征-人類基因組

1、第三節(jié) 基因組結(jié)構(gòu)與特征（三） 人類基因組人體細(xì)胞的核型 細(xì)胞是人體生命活動的基本單位（40萬個） 每個細(xì)胞都帶有人體整套的遺傳基因。 2.5萬個基因，排列在23對染色體上。人類基因組的特征人類核基因組概貌 基因組大?。杭s30億個堿基對； 基因的平均長度：27kb； 外顯子的平均長度：145bp； 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因：約22.5萬個，占總長度的1.5； 非編碼區(qū)比例：9597。 人類核基因組的構(gòu)成一.單一序列（unique sequence） 單一序列在人類基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)或者酶的結(jié)構(gòu)基因?qū)儆趩我恍蛄?。單一序列的基因結(jié)構(gòu)二.重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列（tandem rep

2、eats） 又稱高度重復(fù)序列，在人類基因組中占1015%，有3種類型：1、衛(wèi)星DNA（satellite DNA） 是多種短重復(fù)序列的混合物，重復(fù)序列長度在5100 bp；存在于異染色體以及中心粒和端粒附近，通常不轉(zhuǎn)錄。 小鼠衛(wèi)星DNA的EcoR酶切的電泳掃描圖。 除產(chǎn)生了單體重復(fù)和多聚體重復(fù)單位的整數(shù)倍單位外，還產(chǎn)生了0.5倍，1.5倍，2.5倍等非整數(shù)倍的重復(fù)單位。2、小衛(wèi)星DNA（mini-satellite DNA） 也稱為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeats，VNTRs） 重復(fù)序列長度在10100 bp之間；主要分布于常染色體，有高度的

3、多態(tài)性。3、微衛(wèi)星DNA（micro-satellite DNA） 又稱為簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR）或短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeats， STR）。重復(fù)序列為16個核苷酸，常見(CA)n、(TG)n、(CT)n，重復(fù)次數(shù)多為1560次，總長度一般在400 bp以下。 存在于著絲粒、端粒區(qū)及染色體的其他區(qū)域，直接參與編碼蛋白質(zhì)和參與遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變。 散在重復(fù)序列（interspersed repeats） 屬于中度重復(fù)序列，主要由較大的片段（由100到數(shù)千bp）串聯(lián)重復(fù)組成，分散在整個基因組中，重復(fù)頻率:103105，具有種屬特

4、異性，可作為DNA標(biāo)記。分為3種類型：1.長散在核元件（long interspersed nuclear element, LINE）： 長度1000bp，占基因組20%，與RNA聚合酶有關(guān)，轉(zhuǎn)錄的RNA可編碼逆轉(zhuǎn)錄酶。 短散在核元件（short interspersed nuclear element, SINE）： 長度500bp，占基因組11%，與RNA聚合酶有關(guān)，不編碼逆轉(zhuǎn)錄酶。 rRNA基因、tRNA基因和Alu序列存在散在重復(fù)序列， Alu序列主要為SINE。2.LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR- retroposon)又稱逆轉(zhuǎn)錄病毒樣元件（retrovirus-like elemen

5、ts）3. DNA轉(zhuǎn)座子（DNA transposons）真核生物染色體上的各種重復(fù)順序與結(jié)構(gòu)元件多基因家族是由同一祖先基因經(jīng)過重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因。多基因家族特征：1.基因數(shù)目2個以上； 2.基因功能相似且核苷酸序列具有同源性；3.所編碼的同源蛋白（蛋白質(zhì)家族）具有相似的功能。 多基因家族的某些成員并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因被稱為假基因。假基因的特征: 1.與具正常功能的基因序列相似 2.無轉(zhuǎn)錄功能或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無功能三、多基因家族（multi gene family）和假基因（pseudogene）（一）珠蛋白基因家族（二）組蛋白基因家族Pseudogenes are dead

6、ends of evolution假基因可能是由RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再整合到基因組中產(chǎn)生四、CpG島（CpG island） 哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現(xiàn)的頻率僅有1%，但在基因組的某些區(qū)域中，CpG序列密度很高，可以達(dá)均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，稱為CpG島。 人類基因組中約有28890個CpG島，每個CpG島大約含有12kb，大部分染色體每1 Mb就有515個CpG島，CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對應(yīng)關(guān)系。 人類基因組中所有管家基因以及約一半的組織特異性表達(dá)的基因啟動子區(qū)域都含有CpG島。CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)或是第一個外顯子區(qū)，也有部分的CpG島位

7、于基因的啟動子區(qū)域外。CpG島與甲基化CpG島過甲基化所致基因去表達(dá)，是主要的表觀遺傳學(xué)改變之一。通常只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點(diǎn)通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點(diǎn)則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細(xì)胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG位點(diǎn)則呈高度甲基化狀態(tài)，使抑癌基因去表達(dá)。 CpG島甲基化異常（CpG突變?yōu)門pG），可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。這是由于癌變細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性異常，存在于CpG島的5-甲基胞嘧啶自發(fā)脫氨生成胸腺嘧啶，使甲基化CpG變異為TpG

8、，引起染色體結(jié)構(gòu)、DNA及蛋白質(zhì)因子相互作用方式改變。CpG島甲基化可作為惡變的生物學(xué)指標(biāo)。腫瘤組織中抑癌基因CpG島甲基化水平 在MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)檢測中，乳腺癌組織和外周血BRCA1基因的CpG島甲基化水平明顯高于正常組織。Ramin Radpour. Plos ONE(2011)人類基因組的多態(tài)性（polymorphism） 基因組DNA序列某些堿基位點(diǎn)的變異并不致病，這種在群體中出現(xiàn)頻率高于1%的變異稱為多態(tài)性。多態(tài)性位點(diǎn)與某些疾病的易感性有關(guān)。限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP) R

9、FLP技術(shù)是第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)。在基因組中，不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上，當(dāng)內(nèi)切酶水解DNA序列時(shí)，不同的個體可產(chǎn)生長度不同的DNA片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性，該多態(tài)性片段作為遺傳標(biāo)志。 理論上，凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變（如點(diǎn)突變、DNA序列的插入和缺失等）均可產(chǎn)生RFLP。 但RFLP多態(tài)信息含量低，多態(tài)性水平依賴限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)量，其應(yīng)用受到一定的限制。 小衛(wèi)星與微衛(wèi)星多態(tài)性1.小衛(wèi)星多態(tài)性 當(dāng)將人類的總DNA提取后，用限制性內(nèi)切酶切成不同長度的片段，再以VNTRs中的特異順序?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交，可發(fā)現(xiàn)陽性片段的長度各不相同。 由于不同個體

10、的VNTRs的數(shù)目和位置的差異，使VNTRs的Southern雜交帶譜具有高度的個體特異性，稱為DNA指紋（DNA fingerprints）。 兩種類型： 1）高變小衛(wèi)星（hypervariable minisatellites） 主要位于著絲粒區(qū)，核心單元：924個bp 2）端粒小衛(wèi)星（telomeric minisatellites） 位于染色體亞著絲粒區(qū)，重復(fù)序列：TTAGGG 端粒是真核細(xì)胞內(nèi)染色體末端的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)構(gòu),其功能是完成染色體末端的復(fù)制，使染色體免遭融合、重組和降解。 人的端粒長度大約15kb，結(jié)構(gòu)為染色體末端TTAGGG序列上千次的重復(fù)；細(xì)胞的每次分裂，端粒逐漸縮短

11、，直至細(xì)胞衰老。染色體端粒（telomere）DNA指紋技術(shù)在親權(quán)及法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用 親本之間長度不同的等位基因與DNA指紋分析相結(jié)合，可以確定親本和后代之間的遺傳。來自犯罪現(xiàn)場的血跡指紋*和7個嫌疑者的血液指紋，其中標(biāo)本3和犯罪現(xiàn)場的血跡指紋相同。2.微衛(wèi)星多態(tài)性 微衛(wèi)星DNA（STR）多存在于基因組非編碼區(qū)及內(nèi)含子中，具高度多態(tài)性,是非常重要的一種遺傳標(biāo)記。 STR的類型： 1）單純STR：單一重復(fù)單元組成，如（AT）n 2）復(fù)合STR：2個或以上重復(fù)單元組成，如（AT）n（GT）m 3）間隔STR：重復(fù)序列中含有其他核苷酸，如（AT）n GG （AT）mSTR位點(diǎn)的不穩(wěn)定性與疾病的相關(guān)性

12、: 如果父母本的某個或某些STR重復(fù)次數(shù)超過正常個體的上限，處于一種前突變狀態(tài)，易造成后代相應(yīng)位點(diǎn)核心序列重復(fù)數(shù)目急劇增加（動態(tài)突變）。微衛(wèi)星多態(tài)性脆性X染色體綜合癥臨床特點(diǎn)： 中度重度智力低下 語言障礙 特殊體征：長臉、招風(fēng)耳、大睪丸。發(fā)病機(jī)理: 與FMR-1基因的CGG區(qū)的重復(fù)次數(shù)( CGG )n有關(guān) CGG區(qū)的重復(fù)次數(shù)： 正常人： 60次攜帶者：約60100次患者： 100次單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)等位基因的多態(tài)性，即在一個群體中基因組內(nèi)某一基因座位上可以有兩個或兩個以上的等位基因。同樣，在基因組內(nèi)某一特定核苷酸位置上，也

13、可以有不同的核苷酸。SNP指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸，其中最少一種在群體中的出現(xiàn)頻率大于1%（頻率小于1%為點(diǎn)突變）。 SNP與RFLP和STR等DNA標(biāo)記的主要不同是不再以長度的差異作為檢測手段，而直接以序列的變異作為標(biāo)記。 SNPs在人類基因組中廣泛存在，已分類的SNPs有數(shù)百萬個。在單個基因或整個基因組中的分布不均勻，多存在于非轉(zhuǎn)錄序列中。 SNPs在基因組中的分布比RFLP、STRs更為普遍，絕大多數(shù)DNA多態(tài)性為SNPs，人類基因組中90%的多態(tài)性屬于SNPs。 SNPs的分類： 1）基因編碼區(qū)SNPs（coding region SNPs，cSNPS） 2）基因

14、周邊SNPs（perigenic SNPs，pSNPs） 3）基因間SNPs（intergenic SNPs，iSNPs）SNP的分布及類型SNPs-遺傳多樣性的分子基礎(chǔ)當(dāng)比較兩個隨機(jī)個體的7號染色體上的一段DNA序列時(shí)，在2200個核苷酸中出現(xiàn)兩個單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（SNPs）。SNP的特點(diǎn)1.單個堿基的變異（主要是置換，也有缺失和插入）引起的DNA序列多態(tài)性。 2.CG序列出現(xiàn)最為頻繁，多為C轉(zhuǎn)變?yōu)門。 CG中C常甲基化、自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。3.在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的SNP與蛋白的功能有關(guān)，對致病具有重要意義。4.是新一代的遺傳標(biāo)記(第三代遺傳標(biāo)記）。 通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)和定位疾病基

15、因 如：骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、心血管疾病、腫瘤等的基因定位及遺傳病的單倍型診斷。 指導(dǎo)用藥和藥物設(shè)計(jì) 通過研究遺傳多態(tài)性與個體對藥物敏感性或耐受性的相關(guān)性，可闡明遺傳因素對藥物效用的影響。用于進(jìn)化和種群多樣性的研究 構(gòu)建整個基因組的SNP圖譜，對比人群之間SNP圖譜的異同。SNP主要用途人類基因組單體型圖（Haplotype Map，HapMap）計(jì)劃 在人類基因組的30億個單核苷酸中，常見的SNP位點(diǎn)有數(shù)百萬個。這些差異中的一部分造成了人們罹患疾病風(fēng)險(xiǎn)的不同。 HapMap分為兩個階段，第一階段是對整個人類基因組的30億個堿基進(jìn)行平均5千個堿基（5kb）密度的SNP分型測定，構(gòu)建“5kb單體型

16、圖”。第二階段是在第一階段基礎(chǔ)上進(jìn)行更高密度的分型測定和后期數(shù)據(jù)的分析，以獲得更精細(xì)的單體型圖。 HapMap計(jì)劃的目標(biāo)是通過比較不同個體的基因組序列來確定染色體上共有的變異區(qū)域，幫助生物醫(yī)學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)與疾病或個體對藥物反應(yīng)相關(guān)的基因。一旦從HapMap中獲得標(biāo)簽SNPs的信息，研究者將能利用它們來定位與重要醫(yī)學(xué)特征相關(guān)的基因?？梢约醒芯靠赡芘c疾病相關(guān)的特定候選基因，也可以縱觀整個基因組來找到與疾病相關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域。 中國在整個項(xiàng)目中承擔(dān)10%的任務(wù)，即構(gòu)建第3號、第21號染色體和第8號染色體短臂的單體型圖。 單體型的起源 圖示兩個祖先染色體經(jīng)過多代的重組拼接產(chǎn)生不同的子代染色體。 如果

17、祖先染色體上的一個多態(tài)位點(diǎn)（用X作為標(biāo)記）會增加罹患某種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，兩個遺傳了祖先染色體帶X標(biāo)記部分的子代個體也會增加這種風(fēng)險(xiǎn)。 被X標(biāo)記的位點(diǎn)附近有許多SNPs可以用來定位該變異位點(diǎn)。 HapMap的研究策略 分為三個步驟：（a）在多個個體的DNA樣 本中鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNPs）；（b）將群體中頻率大于1%的那些共同遺傳的相鄰SNPs組合成單體型；（c）在單倍型中找出用于識別這些單體型的標(biāo)簽SNPs。 通過對圖中的三個標(biāo)簽SNPs進(jìn)行基因分型，研究者可以確定每個個體擁有圖示的4個單體型中的哪一個。 拷貝數(shù)多態(tài)性（copy number polymorphisms，CNPs) 在所有人類

18、和其它哺乳動物中，有許多DNA片段大小從200bp2Mb范圍內(nèi)的拷貝數(shù)突變，涉及一個或連續(xù)的幾個基因。這些拷貝數(shù)的刪除、插入、復(fù)制和復(fù)合多位點(diǎn)的變異統(tǒng)稱拷貝數(shù)多態(tài)性（copy number polymorphisms，CNPs) 或者拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs) 。 在全基因組測序和基因芯片技術(shù)發(fā)明前，受限于基因組內(nèi)高通量DNA拷貝數(shù)檢測手段，人們對全基因組范圍內(nèi)CNP數(shù)量和分布知之甚少。2004年，全球內(nèi)數(shù)個HGP研究基地意外地發(fā)現(xiàn)，表型正常的人群中,不同的個體間在某些基因的拷貝數(shù)上存在差異,一些人丟失了大量的基因拷貝，而另一些人則擁有額外、延長的基因拷貝，研究人員稱這種現(xiàn)象為“基因拷貝數(shù)多態(tài)性”。 由于CNP才造成了不同個體間在疾病和藥效等方面的差異。研究