實驗操作指導(dǎo)書：棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的實驗

1、PAGE 1PAGE 226（九）棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的實驗 棉子糖是一種非還原性三糖，與蔗糖有相似的結(jié)構(gòu)： 蔗糖酶水解棉子糖，可得到雙糖（密二糖）和單糖（果糖），果糖是還原糖。棉子糖水解的速度可以用所生成的還原糖來進行測定，由于本實驗是要測定棉子糖和果糖對蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用，為了排除果糖的干擾，就要選用一種專一地特異性測定葡萄糖的方法，本實驗采用葡萄糖氧化酶法來測定反應(yīng)中生成的葡萄糖。這一方法的反應(yīng)如下： 葡萄糖氧化酶 Glucose + H2O H2O2 + Gluconic acid Glucose Oxidase 過氧化物酶 H2O2 + oDianiside + H+ H2O

2、 + Yellow pigment (Reduced dye) Peroxidase (Oxidized dye) 鄰聯(lián)茴香胺 黃色色素 反應(yīng)生成的黃色色素與葡萄糖含量成正比，用分光光度法測定420nm的吸光度值A(chǔ)420。 葡萄糖氧化酶試劑的配制方法為： 溶液A：40mg辣根過氧化物酶（存于冰凍格）溶于1000ml 0.1mol/L pH7.0的磷酸鈉緩沖液，加1500單位葡萄糖氧化酶（每組學(xué)生150ml）（當日新鮮配制）（教師配） 溶液B：溶解0.66g oDianisidediHCl鄰聯(lián)茴香胺染料于100ml H2O中(先用少量冰乙酸溶解后再加H2O)，置于棕色瓶冷藏。不可接觸皮膚，是致癌

3、物（教師配）。使用時取“溶液A”100ml加“溶液B”1ml。（稱GO試劑） 表5 葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖的標準曲線 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖(2mmol/L) H2O GO試劑 4N HCl / 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.601.0 0.95 0.90 0.80 0.70 0.50 0.404.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 混合，室溫下每管準確反應(yīng)15min0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混合，至少放置5min A420 葡萄糖moles數(shù) 表 6 抑制劑（棉子糖與果糖）對酶活性的影響 1 2 3 4 5 6

4、 7 8 9 10(空白) (校 正)0.5mol/L蔗糖H2O乙酸緩沖液*蔗糖酶GO試劑4N HCl / 0.02 0.04 0.06 0.10 0.13 0.15 0.20 0.10 0.20 0.7 0.68 0.66 0.64 0.60 0.57 0.55 0.50 0.70 0.600.20.1 / / 室溫下準確反應(yīng)10min，立即放入沸水浴加熱2min以中止反應(yīng)，再立即放入冰浴速冷。4.0 混合均勻，室溫下準確反應(yīng)15min。0.1 混合均勻，室溫放置5min。 A420 *：試測酶濃度時，0.1ml酶溶液應(yīng)使第8管得到1.0左右的吸光度。 實驗方法： 1. 測定葡萄糖的標準曲線

5、 準備7支試管按上面“表5 ”中的步驟進行測定，用A420和葡萄糖的moles數(shù)作圖。 2. 棉子糖和果糖抑制作用的測定 （1）準備26支試管，試管110用上面“表6”所列的方法進行測定，第1管作空白對照，第9、10兩管用作校正蔗糖的水解。 （2）試管1118放入18管同樣量的緩沖液和蔗糖，但還要加0.5ml 0.5mmol/L的棉子糖，然后用H2O補加到0.9ml，加0.1ml同樣的酶溶液開始計時，詳見“表6”，第11管為這一組的空白對照。 （3）試管1926進行同樣的操作，只是用0.5mol/L果糖代替棉子糖。 （4）用9、10管的數(shù)據(jù)修正各管的A420，計算各底物濃度S和反應(yīng)速度V（mo

6、les/nim ），畫出三條VS關(guān)系曲線，計算1/V和1/S，畫出Lineweaver-Burk雙倒數(shù)關(guān)系圖。 （5）根據(jù)Lineweaver-Burk關(guān)系圖評價抑制方式，并計算Km、Vmax由斜率計算棉子糖和果糖的KI，然后分別計算表觀Km。（注：若室溫較低，本實驗可用恒溫水浴恒溫于25或30）。附錄：試劑配制方法： 1. 1M乙酸：取5.8ml冰乙酸（17M）加H2O稀釋至100ml。 2. 0.5M NaOH：稱2g NaOH 溶于100 ml H2O。 3. 0.5M HCl: 取4.2 ml濃HCl（12M）加入H2O中，稀釋到100 ml（注意必須是酸緩慢倒入水中，決不可反之）。

7、4. 0.02M pH7.3 Tris -HCl緩沖液：先配0.1M Tris Buffer貯液：稱1.21g Tris（三羥甲基氨基甲烷MW 121.1）加70 ml H2O溶解，再滴加4M HCl約21 ml，調(diào)pH=7.3，再加H2O至100ml。取此貯液50ml，加H2O 至250 ml。 5. 4M HCl：取166.7ml濃HCl (12M)，加H2O至500ml。 6. 0.02mol/L pH7.3 Tris -HCl緩沖液（含0.2mol/L濃度NaCl）： 稱0.584g NaCl(MW 58.4）用0.02mol/L pH7.3的Tris -HCl緩沖溶液溶解，并定容到5

8、0ml。 7. 0.2mol/L Sucrose：稱3.423g Sucrose(MW 342.3)加H2O溶解，定容到50 ml，分裝在10個小試管中冰凍保存。 8. 0.2mol/L pH4.9乙酸緩沖液。 稱2.461g無水乙酸鈉（MW 82.03）溶于150 ml H2O，加約4050 ml 0.2M乙酸，調(diào)pH=4.9，存于4冰箱，瓶口用薄膜封口。 9. 0.5mol/L Sucrose：稱8.558g Sucrose，加H2O溶解，定容到50 ml，分裝于小試管中，冰凍保存。 10. 5mmol/L Sucrose：取0.5mol/L Sucrose, 沖稀100倍。 11. 4m

9、mol/L Glucose：取40ml 10mmol/L Glucose，加H2O 稀釋至100ml，或稱0.072g Glucose(MW 180.2)，加H2O溶解定容至100 ml。 12. 4mmol/L Fructose ：稱0.072g Fructose(MW 180.2)加H2O溶解，定容至 100 ml。 13. 4mmol/L Sucrose：稱0.137g Sucrose，加H2O溶解定容到100 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。 14. 0.2mol/L 檸檬酸C6H8O7H2O（MW 210.14）：稱4.203g溶于100 ml H2O。 15. 0.2mol/L乙酸：取1.18 m

10、l冰乙酸（17M）或3.3 3ml 36% 乙酸（6M）加H2O至100 ml。 16. 0.2mol/L乙酸鈉：稱1.641g無水乙酸鈉溶于 100 ml H2O。 17. 0.2mol/L磷酸二氫鈉NaH2PO42H2O(MW 156.01)：稱3.120g溶于100 ml H2O。 18. 0.2mol/L磷酸氫二鈉Na2HPO412 H2O(MW 358.14)：稱7.163g溶于100 ml H2O。 19. Nelsons試劑： （1）Nelsons A：稱25.0g無水Na2CO3，25.0g酒石酸鉀鈉，20.0g NaHCO3 ，200.0g無水Na2SO4，緩慢溶于H2O，稀

11、釋至1000 ml。 （2）Nelsons B：稱15.0g CuSO45H2O溶于H2O，加2滴濃H2SO4，用H2O稀釋至100 ml，使用時，取50ml Nelsons A，加入2ml Nelsons B，此溶液易出結(jié)晶，可保存在高于20處，若出現(xiàn)結(jié)晶，可用溫?zé)崴∪芑?20. 砷試劑（偶氮砷鉬酸鹽試劑）（教師配）： 稱50.0g鉬酸銨，溶于900 ml H2O，攪拌下緩慢加入42 ml濃H2SO4，再稱6.0g砷酸鈉或砷酸氫二鈉，溶于50 ml H2O，混合這兩份溶液，加H2O至1000 ml，37保溫2448小時，室溫暗處存于棕色塑料瓶。 21. 4mol/L尿素（脲）：稱12 .01g (NH2)2CO (MW 60.06)，溶于30 ml H2O，加H2O稀釋至50 ml。 22. 0.5mol/L棉子糖Raffinose： 稱2.97g棉子糖（密三糖）（MW 594.53），溶于6 ml H2O，稍加熱助溶，加H2O稀釋至10 ml，當日新配，