流式細(xì)胞術(shù)樣品制備

1、流式細(xì)胞術(shù)樣品制備流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第1頁 FCM樣品制備包含單分散細(xì)胞懸液制備技術(shù)，細(xì)胞生物學(xué)特征標(biāo)識技術(shù)及熒光染色技術(shù)，F(xiàn)CM是對細(xì)胞或細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和一些功效進(jìn)行定量測定，并能夠依據(jù)細(xì)胞亞群特點(diǎn)性質(zhì)對其進(jìn)行分類技術(shù)。FCM試驗(yàn)對象是單細(xì)胞或單細(xì)胞核懸液，在FCM技術(shù)中制備出合格單細(xì)胞懸液是非常主要步驟，這些單細(xì)胞懸液主要起源于單層細(xì)胞、血液、脫落細(xì)胞、實(shí)體組織及石蠟包埋組織等。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第2頁 一、單層培養(yǎng)細(xì)胞分散為單個細(xì)胞 貼壁單層培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備操作步驟：1、將單層培養(yǎng)細(xì)胞(對數(shù)生長久)中舊培養(yǎng)液倒掉。2、加入少許0.25%胰酶，消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞稍變圓時

2、，馬上終止消化（假如含有10%胎牛血清培養(yǎng)基），搜集細(xì)胞，離心后去上清，PBS液洗滌細(xì)胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散。3、假如不是及時上機(jī)檢測，則需要對細(xì)胞進(jìn)行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保留于4冰箱中。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第3頁（二）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備操作步驟：1、離心去除舊培養(yǎng)液，PBS液洗滌細(xì)胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散。2、假如不是及時上機(jī)檢測，則需要對細(xì)胞進(jìn)行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保留于4冰箱中。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第4頁 二、實(shí)體組織單分散細(xì)胞制備 新鮮實(shí)體組織 新鮮實(shí)體組織是手術(shù)或活檢

3、后依據(jù)檢測目標(biāo)而采取樣品，此樣品應(yīng)及時進(jìn)行適當(dāng)保留處理，如及時用固定劑或低溫對組織進(jìn)行保留，以防止因?yàn)槭覝剡^高、放置時間過長而造成組織自溶，影響檢測結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第5頁新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法以下： 酶消化法 機(jī)械法 剪碎法 網(wǎng)搓法 研磨法 化學(xué)試劑處理法流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第6頁 酶消化法 酶對實(shí)體組織分散作用原理主要有三方面： 一是能夠破壞組織間膠原。 二是能夠水解組織細(xì)胞緊密連結(jié)裝置蛋白性物質(zhì)。 三是能夠水解組織間粘多糖物質(zhì)。 酶消化法是實(shí)體組織分散為單細(xì)胞主要方法，常見酶類試劑有： 蛋白酶類，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈蛋白酶和中性蛋白酶等)都能夠釋放全部組織中細(xì)胞； 胰

4、酶，能水解脂鍵和肽鍵； 膠原酶，能降解幾個分子類型膠原； 溶菌酶，能水解糖蛋白和肽糖苷鍵； 彈性蛋白酶，能消化連接組織糖蛋白和彈性蛋白纖維，可用于解離血管、心臟和肝臟細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第7頁 為使組織細(xì)胞分散下來，應(yīng)用酶學(xué)方法必須注意條件選擇和影響原因： 酶需要溶解于適當(dāng)溶液中，而這種溶液不致于造成 酶效價降低 注意組織在消化液中消化時間 注意酶活性PH值 注意酶適用濃度 隨時注意影響酶活性其它原因 各種酶分散程度都有一定限制性，尤其是在進(jìn)行免疫標(biāo)識試驗(yàn)時，酶處理可能改變細(xì)胞膜成份，從而影響細(xì)胞亞群區(qū)分。應(yīng)指出，用于組織分散很多酶是不夠純，不但含有一個占主導(dǎo)酶，而且在不一樣程度上也混有其

5、它污染物質(zhì)，它們活性可能有利于組織分散，也可能對組織結(jié)構(gòu)或功效產(chǎn)生不利影響。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第8頁酶學(xué)方法普通程序：將適合于酶消化組織置于離心管中。將選好酶溶液1-2ml加入盛有被消化組織試管中。普通消化20-30分鐘(恒溫37C或室溫)，消化期間要間接振蕩或吹打。終止消化，搜集細(xì)胞懸液，以尼龍網(wǎng)(200目)過濾，除去大團(tuán)塊，以低速離心除去細(xì)胞碎片。將制備好單細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析或保留。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第9頁 機(jī)械法 機(jī)械法分裂實(shí)體組織包含：用剪刀剪碎或用尖銳解剖刀剁碎，用勻漿器勻漿，用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞以分散細(xì)胞，采取網(wǎng)搓法一樣也能取得大量細(xì)胞，機(jī)械法易造成細(xì)胞懸液中細(xì)胞碎片，所以機(jī)械

6、法常與其它方法配合使用。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第10頁常見幾個機(jī)械法制備過程以下：剪碎法：將組織塊放入平皿中，加入少許鹽水。用剪刀將組織剪至勻漿狀。加入10ml生理鹽水。用吸管吸收組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。離心沉淀1000prm3-5分鐘，再用生理鹽水洗三次，每次以短時低速離心沉淀(500-800prm)去除細(xì)胞碎片。以300目尼龍網(wǎng)過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊。70%冰乙醇固定，放入4冰箱。 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第11頁網(wǎng)搓法：將100目銅網(wǎng)扎在小燒杯上。把剪碎組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。用300目標(biāo)尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液除去大團(tuán)塊搜集細(xì)胞懸液，離心

7、沉淀1000prm，5分鐘。 70%乙醇固定，置4冰箱備用。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第12頁研磨法準(zhǔn)備一只70ml組織研磨器將組織剪碎至小塊。放入組織研磨器中，加入1-2ml生理鹽水。轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿即可。加入生理鹽水10-20ml，沖洗研器。搜集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀500-800prm，1-2分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心沉淀。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第13頁 化學(xué)試劑處理法 化學(xué)試劑處理法主要原理是將細(xì)胞間起粘連作用 鈣鎂離子置換出來，從而使細(xì)胞分散下來。 試劑配制： 0.2%EDTA配制 EDTA0.2g溶解后，加入Hanks液100ml，封裝高壓消毒，置0-4保留。 胰酶加

8、EDTA配制 胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.2%。 各取40ml混合，分裝置冰箱保留，用時過濾既可。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第14頁試驗(yàn)步驟：將組織切成薄片放入試管。加入EDTA液5ml，室溫，半小時，棄之。加入胰酶+EDTA液5-10ml，在37恒溫水浴30分鐘，間斷振蕩3-5次。用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000prm，5分鐘，再以生理鹽水洗2-3次，離心500-800prm，1-2分鐘。70%乙醇固定置冰箱中被檢。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第15頁 試驗(yàn)證實(shí)，用化學(xué)試劑處理組織造成細(xì)胞成活率降低，細(xì)胞產(chǎn)額

9、較低，細(xì)胞碎片和細(xì)胞叢結(jié)量不穩(wěn)定，所以，化學(xué)試劑處理方法不單獨(dú)使用，可與其它方法聯(lián)合使用。 機(jī)械法經(jīng)常造成嚴(yán)重細(xì)胞損傷，較低細(xì)胞產(chǎn)量，為使細(xì)胞碎片不影響FCM檢測結(jié)果，需采取適當(dāng)方法除去碎片或盡可能降低碎片。 酶學(xué)法對實(shí)體腫瘤分散解聚是較理想，不過會對所測化學(xué)成份造成不良影響，所以依據(jù)使用目標(biāo)去選擇適當(dāng)單細(xì)胞懸液制備方法，才能取得理想樣品和更加好FCM結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第16頁注意事項(xiàng)：新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時進(jìn)行保留，以免組織在室溫下放置時間過長，造成細(xì)胞自溶造成DNA降解，影響FCM測定結(jié)果。依據(jù)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)選取最正確細(xì)胞固定方法，以免因?yàn)楣潭▌┰?，造成FCM檢測結(jié)果不穩(wěn)定。酶學(xué)法要注意條件

10、選擇和影響原因，要注意酶溶劑，消化時間、pH值、濃度等方面對酶消化法影響。需注意不一樣組織選取適當(dāng)方法，如富于細(xì)胞腫瘤(淋巴瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化癌、髓樣癌以及一些軟組織肉瘤)不一定要用酶學(xué)或化學(xué)法，往往用單獨(dú)機(jī)械法就能夠收到大量單分散細(xì)胞。在使用酶學(xué)方法時，要重視酶選取，如含有大量結(jié)締組織腫瘤，如食管癌、乳癌、皮膚癌等，用膠原酶為好，因?yàn)槟z原酶含有在Ca2、Mg 2存在或在血清狀態(tài)下不發(fā)生活性降低特征。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第17頁試驗(yàn)方法：石蠟包埋組織在切片機(jī)上切取40-50m厚組織片3-5片。將切取組織片放入試管中。加入二甲苯5-8ml脫蠟(在室溫下)，1-2天，視石蠟脫凈是否，可

11、更換一次二甲苯，蠟脫凈后棄去二甲苯。水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度酒精5ml，每步10分鐘，去乙醇，加入蒸餾水3-5ml，10分鐘后棄之。消化：加入2ml 0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37恒溫水浴中消化30分鐘，消化期間每隔10分鐘振蕩一次。石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第18頁消化30分鐘后，馬上加入生理鹽水終止消化。經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化完組織片能夠二次消化。搜集細(xì)胞懸液，離心沉淀1500prm，以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀1500prm，再以生理鹽水漂洗1-2次，離心沉淀500-800prm，去碎片。制備好單細(xì)胞懸液作涂片，AO染

12、色在熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)為完整細(xì)胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。單細(xì)胞樣品1106細(xì)胞/ml，加入熒光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4冰箱30分鐘，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第19頁注意事項(xiàng)：一定將石蠟從組織中脫潔凈，檢驗(yàn)是否將石蠟脫凈方法是，棄去二甲苯，加入100%乙醇，如無絮狀物浮起，即視為石蠟已脫凈，反之則沒有脫凈。消化時間不可過長，以免造成已釋放出細(xì)胞核被消化掉。切片不可過薄或過厚，過薄則碎片增多，影響流式分析結(jié)果，過厚造成脫蠟不凈或脫蠟時間過長，普通以40-50m為宜。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第20頁 二、血液單細(xì)胞樣品制備 血液是天然單細(xì)胞分散細(xì)胞懸

13、液，血中細(xì)胞成份在生理狀態(tài)下呈分散游離狀態(tài)，它是流式細(xì)胞分析最適當(dāng)樣品，全血中含有紅細(xì)胞，白細(xì)胞和血小板三種有形成份，但流式細(xì)胞檢測是以某一群細(xì)胞為測定對象，所以在檢測前須將所測某群細(xì)胞分離出來，下面分別介紹幾個血細(xì)胞分離制備方法。 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第21頁 淋巴細(xì)胞制備取肝素抗凝血2.0ml，用生理鹽水2ml將全血稀釋至4ml。先將3ml人淋巴細(xì)胞分離液放入另一個離心管，然后將稀釋后血沿試管內(nèi)壁緩緩加入到分離液面之上，勿用力過大，以免造成血液與分離液混合，保持清楚分層狀態(tài)。離心prm，30分鐘，室溫18-20，離心后可見試管內(nèi)血液清楚分為4層，上層為血漿層，中層為分離液層(淋巴細(xì)胞所處位置

14、在血漿層與分離液層中間)，底層為紅細(xì)胞，紅細(xì)胞上為粒細(xì)胞。用吸管將上層與中層之間淋巴細(xì)胞吸出，搜集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至10ml，離心洗滌2次，每次均以1500prm, 10分鐘，棄上清后即得到純度較高淋巴細(xì)胞，但可有少許單核細(xì)胞。70%冰乙醇固定，置4冰箱保留。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第22頁 粒細(xì)胞制備用淋巴細(xì)胞分離液對細(xì)胞進(jìn)行分層。粒細(xì)胞比重較淋巴細(xì)胞稍大，所以經(jīng)分離液分離后粒細(xì)胞，分層于紅細(xì)胞之上，分離液底部。以吸管慢慢將粒細(xì)胞層吸出，置另一支離心管內(nèi)，以5mlHanks液洗滌三次，每次離心沉淀1500prm，10分鐘。在吸收粒細(xì)胞同時常附帶一些紅細(xì)胞，所以需將紅細(xì)胞去除，加入1.

15、0ml低滲溶液，30-40秒。再以Hanks液洗滌2次，即可取得純度大于95%以上粒細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第23頁 單核細(xì)胞制備1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理 鹽水將血稀釋,均在無菌條件下操作。2.1640培養(yǎng)液10.0ml,放入培養(yǎng)瓶內(nèi),將稀釋血加入 培養(yǎng)液中,混勻,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。3.放入37恒溫箱內(nèi)孵育30-40分鐘,取出培養(yǎng)瓶 ,將血傾倒掉,用生理鹽水將培養(yǎng)瓶輕輕沖洗一次,以去掉殘留血液,這時培養(yǎng)瓶壁上貼附了大量單核細(xì)胞,因?yàn)閱魏思?xì)胞含有短時培養(yǎng)期內(nèi)貼附快特點(diǎn) ,而其它細(xì)胞沒有這個特征,所以利用這一特征進(jìn)行短時培養(yǎng)可取得較純單核細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)

16、樣品制備第24頁4.將粘附于培養(yǎng)瓶壁上單核細(xì)胞消化下來,用0.25%胰酶消化1015分鐘,室溫下,并不停搖震,以促使細(xì)胞脫落下,單核細(xì)胞粘附力很強(qiáng),用酶消化往往取得細(xì)胞數(shù)少,當(dāng)前亦采取機(jī)械方法,用一橡皮刷,伸入培養(yǎng)瓶在瓶壁上輕擦,將細(xì)胞刮取下,但切勿用力過大,造成細(xì)胞損傷過多。5.脫落下來細(xì)胞移入離心管,離心沉淀1500prm,5分鐘,再以生理鹽水漂洗23 次,每次離心800prm,2分鐘,以去除碎片雜質(zhì)。6.將細(xì)胞涂片,以丫啶橙染色,置熒光顯微鏡下觀察形態(tài)和純度。7.將細(xì)胞以70%乙醇固定,置0-4冰箱保留備檢。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第25頁流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第26頁三、脫落細(xì)胞單細(xì)胞懸液制備

17、在臨床實(shí)際工作中，可搜集到大量自然脫落細(xì)胞，這些細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)過簡單處理，就可得到很好單分散細(xì)胞懸液，所以是流式細(xì)胞術(shù)檢測天然樣品，下面介紹幾個常見脫落細(xì)胞樣品制備方法。 宮頸脫落細(xì)胞懸液制備1.首先用生理鹽水沖洗宮頸表面分泌物,以海棉輕拭宮頸表面,將海棉中吸附脫落細(xì)胞洗脫到20ml生理鹽水中。2.搜集細(xì)胞懸液,以1500prm離心沉淀,用生理鹽水洗滌2次,每次5分鐘,棄上清后加入70%乙醇3ml固定備檢。流式細(xì)胞術(shù)樣品制備第27頁食管脫落細(xì)胞懸液制備1.將食管拉網(wǎng)器上細(xì)胞洗脫到10ml生理鹽水中,以1500prm離心沉淀,再用生理鹽水洗滌2次,離心500-800prm1-2分鐘,棄上清。2.調(diào)整細(xì)胞數(shù)在1X106/ml,可進(jìn)行標(biāo)識染色上機(jī),如不馬上檢測可用70% 冰乙醇固定保留。3.在標(biāo)識染色前如發(fā)覺細(xì)