乙醛脫氫酶2對肥胖大鼠心肌的影響

1、 乙醛脫氫酶2對肥胖大鼠心肌的影響 于曉涵Summary：隨著國民生活水平的提高，高脂飲食伴隨的生活習慣逐漸成為大眾主流。研究發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2（ALDH2）是一種在心肌保護方面具有重要作用的醛類氧化酶，能夠改善心肌損傷和動脈粥樣硬化等。因此，該實驗通過高脂飲食構建肥胖大鼠模型，探討ALDH2和心肌保護間的關系。Key：高脂飲食;心肌;乙醛脫氫酶21 前言社會的不斷進步和發(fā)展，帶動了國民的物質(zhì)水平不斷提高。中國居民的膳食習慣正在向以高脂飲食為主的西方膳食模式轉(zhuǎn)變，特別是在大城市，這種現(xiàn)象更為顯著。伴隨著人們膳食金字塔的改變，一系列慢性病的發(fā)病率不斷攀升，尤其是長期進食高脂食物可以增加冠心病的發(fā)病

2、率。流行病學資料顯示，中國城市居民冠心病死亡率高達88.71/10萬，以每年20%的速度增長。并且出現(xiàn)地區(qū)和性別差異，城市高于農(nóng)村，男性高于女性，在發(fā)達的沿海城市這種情況更為顯著1。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是由冠狀動脈血管變窄或被阻塞使得心肌缺氧或梗死而引起的心臟病，簡稱冠心病，又被稱為缺血性心臟病。過量攝入高脂食物后，會造成膽固醇和甘油三脂長期處于高水平狀態(tài)，容易使動脈發(fā)生粥樣硬化，引發(fā)心臟內(nèi)的血液供給不足，致使心肌受損，最終引發(fā)冠心病。由于高脂食物中含有較多的飽和脂肪酸，經(jīng)科學證實攝入飽和脂肪酸的量越多，冠心病的患病率就越大，二者呈正相關。冠心病已經(jīng)影響到人類的生活質(zhì)量，成為影響身體健康的

3、首要危險因素。因此如何降低高脂飲食模式對冠心病的發(fā)病率是目前亟待解決的重要問題。乙醛脫氫酶（ALDH）是醛脫氫酶中的一種，包含19個成員，每個成員由不同的染色體上基因編碼。ALDH一共包括三類，存在于線粒體上的乙醛脫氫酶2（ALDH2）是其中的第二類。ALDH2是一種重要的醛類氧化酶，具有脫氫酶和酯酶的功能，能夠催化乙醇的代謝產(chǎn)生乙醛并將其氧化為醋酸，然后將乙醛衍生物4-羥壬烯醛（4-HNE）氧化分解，生成無毒的酸，減輕活性氧和醛類氧化酶生成對細胞造成的損傷2。研究表明，ALDH2是不僅是酒精代謝的關鍵酶，還可以保護由氧化應激造成的細胞損傷。另有研究表明，在缺血再灌注損傷中，隨著ALDH2活性

4、的提高，心梗出現(xiàn)的面積就越小，呈現(xiàn)反關系，證實ALDH2具有改善心臟功能，保護心肌的重要作用。目前關于冠心病與ALDH2的基因多態(tài)性之間的關系有很多研究。從它的生物學特性來看，ALDH2基因的12 號外顯子的鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰蕰r，此時谷氨酸被替換為賴氨酸，根據(jù)該突變，ALDH2基因型在人群中就形成了3種組合方式：GG型（野生純合子）、GA型（雜合子）和AA型（突變純合子）。國內(nèi)外在這兩者的關系上有大量研究，有研究者選取了89名心梗患者和142名不穩(wěn)定型心絞痛患，把231名患者分為ALDH2*1/ALDH2*1型（n=145）和ALDH2*1/ALDH2*2，ALDH2*2/ALDH2*2型（n

5、=86）兩組，結果發(fā)現(xiàn)突變型患者心梗發(fā)病率高于野生型患者。日本的一項研究顯示，ALDH2突變基因型成為了日本男性心梗的危險因素之一。但是進一步研究顯示，ALDH2的突變型基因只是心梗發(fā)生的主要危險因素，與冠狀動脈損傷的嚴重等級沒有關聯(lián)。研究提示，存在ALDH2*2等位基因的人患冠心病的風險更高，并且攜帶ALDH2*2的基因是心肌梗死和急性冠脈綜合癥中的主要危險因子，可能與ALDH2 活性降低后導致體內(nèi)脂質(zhì)積累、蛋白質(zhì)合成受阻、活性氧增加等因素有關，不過具體的機制尚未明確。在既往的研究中顯示，ALDH2活性的提高可以減慢動脈粥樣硬化的進展，減輕乙醇對肝臟的損傷，減弱氧化應激反應的發(fā)生，對酒精中毒

6、可以起到解毒和治療的作用?？偨Y以上探究，ALDH2與心血管疾病密切相關，如冠心病，缺血再灌注損傷等。所以研究ALDH2在心血管疾病治療方面的作用具有很重要的臨床價值。本實驗擬通過高脂飲食構建肥胖大鼠模型，同時結合血清中總膽固醇（TC）和肌酸激酶（CK）的變化，探討ALDH2和心肌保護間的關系，為臨床降脂和心肌保護提供一定的實驗數(shù)據(jù)。2 材料與方法2.1材料2.1.1 實驗動物清潔級SD大鼠雄性24只，2月齡，體重約290g。購于湖北實驗動物研究中心。所有大鼠均自由進食，室溫 214攝氏度下飼養(yǎng)。2.1.2儀器和試劑其林貝爾脫色搖床;垂直電泳槽1.5MM標配;VE-180轉(zhuǎn)移電泳槽;高壓電泳儀電

7、源;多功能酶標儀;超級恒溫水浴鍋;小型冷凍高速離心機;電磁攪拌器;上海勤翔超敏熒光及化學反應儀;超聲波細胞粉碎機;優(yōu)普超純水制造系統(tǒng);制冰機。由武漢萬知生物有限公司提供BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒;南京建成生物有限公司提供總膽固醇和肌酸激酶試劑測試盒。2.1.3 取材在干預后用戊巴比妥鈉麻醉后，取心肌組織于-80冰箱中冷凍。通過眼球取血5ml靜置30min后放于4冷柜過夜，隔天用1000轉(zhuǎn)/分鐘*10分鐘的模式進行離心，離心后取上層血清保存于-20的低溫環(huán)境中。2.2方法2.2.1高脂乳劑的配制取500ml規(guī)格的燒杯，將20g豬油放在燒杯中用磁力攪拌器加熱到100后，加入2g膽固醇，用玻璃棒不斷

8、攪拌使其熔化，再加入2g膽酸鈉攪拌使其溶解。再取一個500ml規(guī)格的燒杯，把20ml吐溫-80和20ml丙二醇倒入燒杯中用磁力攪拌器加熱至60，然后加入1g丙硫氧嘧啶。等到丙硫氧嘧啶充分溶解后，將兩個燒杯中的液體混勻。2.2.2實驗分組適應性飼養(yǎng)一周后的大鼠隨機抽取8只作為普食對照組（ND）提供標準飼料，另外16只給予高脂乳劑。并再將其隨機分為兩組，即高脂對照組（持續(xù)灌高脂乳劑，HR）、飲食限制組（DR，前四周喂食高脂乳劑，后四周喂食標準飼料）。八周后進行取材。2.2.3 總膽固醇指標檢測南京建成公司試劑盒提供的酶標儀測試方法：在空白孔，標準孔和校準孔中分別加入2.5微升的雙蒸水，標準品和樣本

9、;接著將所有孔中加入250微升的工作液;混勻96孔板中各孔的液體;37孵育10分鐘;用酶標儀設置510nm的參數(shù);依據(jù)公式計算吸光度。2.2.4 肌酸激酶活力測試南京建成公司試劑盒提供的酶標儀測試方法：測定管中加入20微升的待測樣本;接著將300微升的混合試劑分別加入測定管和對照管中;振蕩混勻，37攝氏度，水浴20分鐘。水浴之后，在對照管中加入20微升的待測樣本，接著把試劑六分別加入兩種管里，振蕩混勻，每分鐘500轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)10分鐘，取上清加入定磷劑?；靹騼蓚€管中的液體，浴調(diào)至45加熱15分鐘。雙蒸水調(diào)零設定參數(shù)660nm，測各管的吸光度。2.2.5 Western blot法測定ALDH2蛋白表

10、達提取心肌組織中的總蛋白：稱取大鼠心肌組織，將其剪成小塊;加入蛋白酶抑制劑液和蛋白裂解液2ml，充分研磨;用超聲將細胞裂解后離心10分鐘，離心后用取上清;加入Loading Buffer后煮樣5分鐘;BCA法測定蛋白濃度。配制SDS凝膠：配制前將兩塊玻璃板安裝完畢，將配好得分離膠試劑（去離子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 8.8PH，SDS，過硫酸銨AP，TEMED）快速混勻，抓緊注入玻璃板間隙，直至玻璃板2/3高度，蒸餾水封膠，靜置半小時后，倒掉水;接著把濃縮膠混合液（去離子水，2-丙烯酰胺，Tris-Hcl 6.8PH，SDS，過硫酸銨AP，TEMED）注入玻璃板間隙中直至小玻璃板位置

11、;插入梳子，靜置1小時后上樣。電泳：85v電壓下跑膠。轉(zhuǎn)膜：撬開兩塊玻璃，去掉上層濃縮膠，只留分離膠，將分離膠放入轉(zhuǎn)膜液中;在轉(zhuǎn)膜夾上按順序放上海綿2層，濾紙3層，SDS凝膠，NC膜，濾紙3層，將其移入含有轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中;接通電源，350mA恒流跑90分鐘。封閉：將NC膜取出放入封閉液中，搖床封閉1小時，封閉結束后在TBST液中清洗25分鐘。孵育一抗：將NC膜按照所需的目的蛋白的分子量進行裁剪;剪好的條帶放入到用5%BSA稀釋過的一抗中，放入冰柜中低溫搖床過夜。孵育二抗：取出抗體中的條帶，在TBST液中漂洗3遍，每遍15分鐘;接著放入稀釋后的二抗中，室溫下?lián)u床孵育2小時;孵育結束之后，重復上

12、面步驟。曝光：按照A：B=1：1提前配制好ECL發(fā)光劑，避光保存;將條帶放進超敏化學反應儀中，加上發(fā)光劑，進行曝光。2.3統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)以均值標準差表示，進行單因素方差分析;各指標間相關采用Person相關分析。統(tǒng)計分析用GraphPad Prism 5和SPSS 20.0軟件處理，P0.05認為具有統(tǒng)計學意義。3 結果3.1 血清總膽固醇（TC）指標與普食對照組相比，高脂對照組的TC值顯著升高（P0.05），并且超過正常范圍的參考值;與飲食限制組相比，高脂對照組的TC值顯著升高（P0.05）。3.2血清肌酸激酶（CK）活性測試高脂對照組和飲食限制組的CK值較普食對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)

13、計學意義（P0.05）。3.3 Western blot檢測ALDH2的蛋白表達高脂對照組ALDH2表達較普食對照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）;高脂對照組ALDH2表達較飲食限制組明顯降低，差異具有顯著性（P0.05）。3.4指標間相關分析TC和CK指標之間具有相關性（P0.05）;TC和ALDH2指標之間具有相關性（P0.05）;CK和ALDH2指標之間具有相關性（P1.5。限制富含膽固醇多的食物，可以多吃洋蔥，大蒜，香菇之類的可以降低膽固醇的食物。以谷物為主;多吃新鮮的瓜果蔬菜，保證各類營養(yǎng)物質(zhì)的均衡攝取。清淡飲食，少鹽少油。限制飲酒量，研究顯示適量飲酒可以提高ALDH2的活性，保護心臟，過度的飲酒則會增加高血壓，心力衰竭，腦猝死的風險。同時，積極參加體育運動，已有研究證實，運動可以預防心血管疾病的發(fā)生并改善疾病程度。本研究通過總膽固醇和肌酸激酶兩個指標判斷心血管疾病的風險，仍需要結合病理形態(tài)學觀察。證實高脂飲食的攝入使得心肌乙醛脫氫酶2表達下降，但是具體的調(diào)控其蛋白表達的分子信號通路不清楚。5 結論八周高脂飲食可引起大鼠血清中總膽固醇和肌酸激酶的水平升高，心肌ALDH2蛋白表達下降，提示心血管疾病風險增加。盡早調(diào)整飲食結構，減少高脂食物的攝入，可以降低血清總膽固醇水平，增加心肌ALDH2蛋白表達，從而降低心血管疾病風險。Re