發(fā)酵動力學實驗

1、發(fā)酵動力學實驗 第1頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 發(fā)酵動力學是研究各種發(fā)酵過程變量在活細胞作用下的變化規(guī)律，以及各種發(fā)酵條件對這些變量變化速度的影響。 以化學熱力學（研究反應的方向）和化學動力學（研究反應的速度）為基礎，對發(fā)酵過程中各種物質(zhì)的變化進行描述。一、發(fā)酵動力學研究的內(nèi)容2第2頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二研究內(nèi)容微生物生長動力學基質(zhì)消耗動力學產(chǎn)物生成動力學3第3頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二二、研究發(fā)酵動力學的方法 發(fā)酵動力學研究的前提反應器內(nèi)的攪拌系統(tǒng)能保證理想的混合；溫度、pH等環(huán)境條件能夠控制以保持

2、穩(wěn)定；細胞有固有的化學組成，不隨發(fā)酵時間和某些發(fā)酵條件的變化而發(fā)生明顯變化；各種描述發(fā)酵動態(tài)的變量對發(fā)酵條件變化的反應無明顯滯后。4第4頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二1.宏觀處理法：把細胞看成一個均勻分布的物體，不管微觀反應機制，只考慮各個宏觀變量之間的關(guān)系，這樣便得出結(jié)構(gòu)模型和非結(jié)構(gòu)模型2.質(zhì)量平衡法：根據(jù)質(zhì)量守恒定律，對某一物質(zhì)在過程發(fā)生前后的質(zhì)量變化進行恒算。 發(fā)酵動力學研究方法5第5頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二質(zhì)量平衡式物質(zhì)在系統(tǒng)中積累的速度=物質(zhì)進入系統(tǒng)的速度+物質(zhì)在系統(tǒng)中生成的速度-物質(zhì)排出系統(tǒng)的速度-物質(zhì)在系統(tǒng)中消耗的速度某物

3、質(zhì)在系統(tǒng)中的含量能夠在線測量或估計，通過建立上述平衡方程式，就可以確定該物質(zhì)在系統(tǒng)中變化的動力學。人為加入或排出和通過相界面?zhèn)髻|(zhì)進入或排出6第6頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二三、發(fā)酵動力學研究步驟獲得發(fā)酵過程中能夠反映發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)尋求發(fā)酵過程變化的多種理化參數(shù)與微生物發(fā)酵代謝規(guī)律之間的相互關(guān)系建立多種數(shù)學模型，描述多種理化參數(shù)隨時間變化的關(guān)系利用計算機和程序控制，反復驗證多種數(shù)學模型的可行性的適用范圍7第7頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二氧需求好氧發(fā)酵兼性好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵液體表面發(fā)酵液體深層發(fā)酵深層發(fā)酵操作方法分批發(fā)酵分批補料發(fā)酵

4、連續(xù)發(fā)酵微生物發(fā)酵動力學的研究與發(fā)酵的種類、方式密切相關(guān)8第8頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二四、發(fā)酵動力學研究的意義 通過對發(fā)酵反應動力學的研究，進行最佳發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件的控制。發(fā)酵過程中，菌體的濃度、基質(zhì)濃度、溫度、pH值、溶解氧等工藝參數(shù)的控制方案，可以在這研究的基礎上進行優(yōu)化。 設計合理的發(fā)酵過程，也必須以發(fā)酵動力學模型作為依據(jù)，利用計算機進行程序設計、模擬最合適的工藝流程和發(fā)酵工藝參數(shù)，從而使生產(chǎn)控制達到最優(yōu)化。 發(fā)酵動力學的研究還在為試驗工廠比擬放大、為分批發(fā)酵過渡到連續(xù)發(fā)酵提供理論依據(jù)。第9頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 發(fā)酵過程

5、中，基質(zhì)主要消耗在：滿足菌體生長消耗維持微生物生存的消耗合成代謝產(chǎn)物的消耗S，基質(zhì)（底物）；G，菌體生長；M，維持代謝；P，產(chǎn)物合成1、幾個基本概念五、發(fā)酵動力學模型10第10頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二1.維持因數(shù)(m) ：單位重量的（菌體）細胞在單位時間內(nèi)用于維持代謝消耗的基質(zhì)的量。 一般來講指維持細胞最低活性所需消耗的能量。（碳，氮，氧等的維持因數(shù)mc,mn,mo）ms:以基質(zhì)消耗為基準 的維持因數(shù)，X:菌體干重；S:基質(zhì)量t:發(fā)酵時間；M:表示維持。11第11頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二基質(zhì)的消耗速度基質(zhì)的消耗比速率2.比速（率）

6、:單位時間內(nèi)，單位干菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量 (消耗的基質(zhì)用于維持代謝，菌體生長和產(chǎn)物合成)。比速率是生物反應中用于描述反應速度的常用概念12第12頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二菌體的比生長速率產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率13第13頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二3.生長得率：菌體的生長量相對于基質(zhì)消耗量的收得率。YX/s: 相對與基質(zhì)消耗的實際生長得率系數(shù)Yg/s: 相對于基質(zhì)消耗的（純生長）理論得率系數(shù) 特定的基質(zhì)及在特定環(huán)境條件下培養(yǎng)的特定微生物，它是一個常數(shù)，又稱最大生長得率或生長得率常數(shù)。14第14頁，共33頁，2022年，5月20日，

7、4點49分，星期二4.產(chǎn)物得率：產(chǎn)物的合成相對于基質(zhì)消耗量的收得率。YP/s: 相對于基質(zhì)消耗的實際產(chǎn)物得率系數(shù)Yps: 相對于基質(zhì)消耗的產(chǎn)物理論得率系數(shù) 理論產(chǎn)物得率取決于產(chǎn)物的生物合成途徑，對于由特定基質(zhì)經(jīng)特定途徑產(chǎn)生的特定產(chǎn)物來說，它是一個常數(shù)，不因菌株和發(fā)酵條件的不同而異。15第15頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二16第16頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二：菌體的生長比速 s：單一限制性基質(zhì)濃度 Ks：半飽和常數(shù)max: 最大比生長速率s1.Monod方程式2、微生物生長動力學mm/2ks17第17頁，共33頁，2022年，5月20日，4

8、點49分，星期二莫諾方程成立的假設條件：菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)式生長，細胞成分只需要用一個參數(shù)即菌體濃度表示；只有一種底物是生長限制性底物，并且沒有反饋抑制性產(chǎn)物出現(xiàn)；微生物生長沒有動態(tài)滯后性。18第18頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 Monod方程中單一限制性基質(zhì)可以是培養(yǎng)基中任何一種與微生物生長有關(guān)的營養(yǎng)物，只要該基質(zhì)相對缺乏，就成為限制性生長因子。實際過程中，可能出現(xiàn)多種限制性基質(zhì)和抑制性物質(zhì)，影響了Monod方程的適用性。19第19頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二 Ks ，微生物對基質(zhì)的飽和常數(shù),當= 1/2max，s= Ks 當s K

9、s，基質(zhì)濃度較高時，與s無關(guān)，零級反應。 當s趨近于無窮大時，=max.max是理論上最大的生長潛力。mm/2kss20第20頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二米氏方程mm/2kss莫諾方程21第21頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二莫諾方程與米氏方程 二者形式相同，但微生物生長是細胞群體生命活動的綜合表現(xiàn)，機理非常復雜。Monod方程與米氏方程的區(qū)別與聯(lián)系是：Monod方程是對實驗現(xiàn)象的總結(jié)，是經(jīng)驗方程（empirical model）；米氏方程是根據(jù)酶反應機理推導得出，是機理方程（mechanistic model）。22第22頁，共33頁，20

10、22年，5月20日，4點49分，星期二 由于微生物的代謝產(chǎn)物，特別是次級代謝產(chǎn)物的合成途徑特別復雜，其動力學過程不僅受菌體自身基因型的限制，還與其生活的外部條件有密切關(guān)系。目前整個動態(tài)變化過程的規(guī)律仍不是十分清楚，大多數(shù)研究只是限于宏觀變量的非結(jié)構(gòu)模型。3、微生物的產(chǎn)物生成動力學23第23頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二根據(jù)細胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進行分類 Luedeking-Piret模型是一常見的分批發(fā)酵產(chǎn)物合成動力學模型，它把產(chǎn)物生成速率看作是菌體生長速率和菌體濃度的函數(shù)，用數(shù)學式表示為： 式中：與生長偶聯(lián)的產(chǎn)物形成系數(shù) 非生長偶聯(lián)的相關(guān)系數(shù) 24第24頁，共3

11、3頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二偶聯(lián)型：產(chǎn)物生成速率與細胞生長速率有緊密聯(lián)系，合成的產(chǎn)物通常是分解代謝的直接產(chǎn)物，如葡萄糖厭氧發(fā)酵生成乙醇，或者好氣發(fā)酵生成中間代謝物(氨基酸或維生素)。這類初級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)速率與生長直接有關(guān)。式中0，0混合型：生長與產(chǎn)物生成相關(guān)(如乳酸、檸檬酸、谷氨酸等的發(fā)酵)，發(fā)酵產(chǎn)物生成速率可由Luedeking-Piret模型數(shù)學式描述，式中0，0。 該混合型模型復雜的形成是將常數(shù)、作為變數(shù)，它們在分批發(fā)酵的四個時期分別具有特定的數(shù)值。 根據(jù)細胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進行分類 25第25頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二非生長偶聯(lián)

12、型：在生長和產(chǎn)物無關(guān)聯(lián)的發(fā)酵模式中，細胞生長時，無產(chǎn)物，但細胞停止生長后，則有大量產(chǎn)物積累，產(chǎn)物的形成速率只與細胞積累量有關(guān)。產(chǎn)物合成發(fā)生在細胞生長停止之后(即產(chǎn)生于次級生長)，故習慣上把這類與生長無關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物稱為次級代謝產(chǎn)物，但不是所有次級代謝產(chǎn)物一定是與生長無關(guān)聯(lián)的。大多數(shù)抗生素和微生物毒素的發(fā)酵都是非生長偶聯(lián)的例子，非偶聯(lián)型發(fā)酵的生產(chǎn)速率只與已有的菌體量有關(guān)，而比生產(chǎn)速率為一常數(shù)，與比生長速率沒有直接關(guān)系。因此，其產(chǎn)率和產(chǎn)物濃度高低取決于細胞生長期結(jié)束時的生物量。式中0，0根據(jù)細胞生長與產(chǎn)物形成是否偶聯(lián)進行分類 26第26頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二4、微生物

13、的基質(zhì)消耗動力學假設發(fā)酵過程沒有中間代謝產(chǎn)物積累，則含碳基質(zhì)的質(zhì)量平衡算式為：消耗的含碳基質(zhì)=維持代謝消耗量+菌體生長消耗量+產(chǎn)物合成消耗量 即：27第27頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二微分后：式中：ms維持系數(shù)，即單位菌體、單位時間內(nèi)用 于菌體維持生命活動的基質(zhì)量單純用于合成單位菌體所消耗的基質(zhì)量單純用于合成單位產(chǎn)物所消耗的基質(zhì)量上式反映了基質(zhì)消耗與菌體生長及產(chǎn)物生成之間的關(guān)系。因此，當生長動力學模型和產(chǎn)物生成動力學模型確定后，基質(zhì)消耗動力學模型即可確定。28第28頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二六、發(fā)酵動力學實驗設計1.實驗材料菌種：雅致放

14、射毛霉AS3.2778培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基（參考實驗指導）試劑：DNS試劑2.實驗步驟菌種斜面培養(yǎng)：配制PDA培養(yǎng)基100ml，分裝試管，滅菌后擺成斜面，將雅致放射毛霉接種于斜面上，25 培養(yǎng)48h。種子培養(yǎng)：斜面菌種在25恒溫培養(yǎng)48h 后，轉(zhuǎn)接于500mL 搖瓶，裝液量為150 mL，160 r/min 25 ，搖床培養(yǎng)16h為種液。29第29頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二發(fā)酵培養(yǎng): 5 L 發(fā)酵罐中裝入3.5 L 的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在在121 下滅菌30 min，溫度降至30 時，接入種液，接種量為4%控制適宜的通氣比、保持罐壓為0.05

15、 MPa、發(fā)酵溫度30 、攪拌速度160 r/min條件下發(fā)酵84h每12 h 取樣1 次進行菌體生長量、還原糖產(chǎn)量、蔗糖糖消耗測定結(jié)果為3 次重復。3.分析方法菌體生物量的測定：采用比濁法，發(fā)酵液以蒸餾水稀釋，5000 r/min 離心10 min，除去上清液，菌體沉淀用生理鹽水洗2-3次再離心去上清液，用生理鹽水重懸并進行適當稀釋，測定其OD600nm。30第30頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二還原糖的測定：（1）在堿性條件下，還原糖與3、5二硝基水楊酸共熱，3、5二硝基水楊酸被還原為3氨基5硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質(zhì)。在一定范圍內(nèi)，還

16、原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度呈一定的比例關(guān)系，可在722型分光光度計540nm波長測定棕紅色物質(zhì)的吸光度值。查標準曲線計算，可求出發(fā)酵液中還原糖的含量。（2）取4支干燥試管,編號,按下表所示的量,精確加入待測液和試劑(ml):管號項目 空白 還原糖 0 1 2 3樣品量 0 2.0 2.0 2.0蒸餾水 3.5 1.5 1.5 1.53、5二硝基水楊酸試劑 1.5 1.5 1.5 1.5總體積 5.0 5.0 5.0 5.031第31頁，共33頁，2022年，5月20日，4點49分，星期二加完試劑后, 將各管搖勻，戴上小漏斗，在沸水浴中加熱5分鐘，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水 20.0ml，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。切勿用力振搖，引入氣泡。在540nm波長下，